張雪妍，秦小明, 2，林海生, 2，曹文紅, 2，鄭惠娜, 2，高加龍, 2，章超樺, 2

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088； 2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心 (湛江) /南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524088）

近年來男性不育癥的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，調(diào)查顯示全球8%～12%育齡夫婦患有不育癥[1]，其中歸因于男性伴侶的占近50%[2]。生殖系統(tǒng)疾病[3]、環(huán)境污染[4-5]、內(nèi)分泌失調(diào)[6]和藥物[7]引起的生殖損傷均可導(dǎo)致男性不育。睪丸的生殖激素改變[6]、細(xì)胞凋亡[8]、氧化損傷[9]和組織結(jié)構(gòu)異?？赡苁悄行陨彻δ苷系K的機(jī)制。睪丸支持細(xì)胞作為睪丸生精的“營養(yǎng)細(xì)胞”，為生殖細(xì)胞發(fā)育、存活和成熟提供微環(huán)境，其所形成的血睪屏障可有效保護(hù)生殖細(xì)胞免受有毒物質(zhì)的破壞。因此，體外研究睪丸支持細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的敏感性可能是間接衡量這些物質(zhì)在精子形成中發(fā)揮作用的有效途徑。雷公藤 (Tripterygium wilfordii Hook. f.) 中藥制劑在臨床上長期用于治療炎癥及免疫系統(tǒng)疾病，而雷公藤甲素 (TP,C20H24O6) 作為雷公藤的藥理和毒性作用的主要有效成分[10]，其副作用中發(fā)生率最高的是生殖毒性[11]。TP攝入過多會(huì)導(dǎo)致睪丸萎縮、激素合成代謝紊亂及精子活力下降等[11-12]。研究表明，TP可降低TM4小鼠睪丸支持細(xì)胞存活率、增加細(xì)胞活性氧 (ROS)蓄積并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的激活[13]。因此，TP的生殖毒性極大限制了其臨床應(yīng)用。

香港牡蠣 (Crassostrea hongkongensis)，俗稱生蠔，因其肉質(zhì)鮮美，富含蛋白質(zhì)、糖原、氨基酸、脂肪酸和無機(jī)鹽等[14]，被冠以“海洋牛奶”的美稱[15]。牡蠣已被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為藥食兩用材料[16]。牡蠣肉提取物具有抗氧化[17]、增強(qiáng)機(jī)體免疫[18]、抗疲勞[19]、抗皮膚光老化[20]、降血壓[21]、降血糖[22]、醒酒護(hù)肝[23]和生殖保健[24]等多種生物活性。研究表明，小分子牡蠣多肽可提高小鼠血清性激素水平及其精子質(zhì)量[25]。Li等[26]發(fā)現(xiàn)近江牡蠣 (Ostrea rivularis) 多糖可抑制過氧化氫 (H2O2) 誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，改善環(huán)磷酰胺所致小鼠睪丸組織損傷，提高精子存活率并減少精子畸形?？梢娔迪犎馓崛∥锞哂懈纳菩坌陨彻δ艿臐撃?，但其有效成分、作用機(jī)理尚不明確。本研究以香港牡蠣為原料，以TM4小鼠 (Mus musculus) 睪丸支持細(xì)胞株為研究對(duì)象，探究牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)的TM4小鼠睪丸支持細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，在細(xì)胞水平上探討牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP抗生育作用的減毒效果，以期為研發(fā)以牡蠣為原料的改善男性生殖健康的保健功能食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香港牡蠣購于湛江海鮮批發(fā)市場(chǎng)，動(dòng)物蛋白酶 (酶活力 3×104U·g?1) 購于廣西南寧龐博生物有限公司，DMED/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司，馬血清、青/鏈霉素雙抗購自HyClone公司，噻唑蘭(MTT) 購自 Genview 公司，TP (純度>98%) 購自美倫生物技術(shù)有限公司，還原型谷胱甘肽 (GSH) 測(cè)定試劑盒和丙二醇 (MDA) 測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，ROS檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自碧云天生物研究所，小鼠睪丸支持細(xì)胞株 (TM4) 購于廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XX42PMINI超濾裝置 (美國 Milipore 公司)；Lynx6000高速落地離心機(jī) (美國Thermo公司)；R-1005旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；1200型半制備高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)；7500cx電感耦合等離子體質(zhì)譜 (ICP-MS，美國Agilent公司)；HHT4-LX-C50L型立式壓力蒸汽滅菌器 (北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；CKX41型倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) (蘇州凈化有限公司)；Forma 370型二氧化碳 (CO2) 恒溫箱 Multiskan FC型酶標(biāo)儀 (美國Thermo公司)；5810R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) (德國 Eppendorf公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣酶解產(chǎn)物超濾組分的制備 取新鮮牡蠣肉，經(jīng)洗凈、瀝干，然后按料水質(zhì)量體積比1∶3 (g·mL?1) 加入預(yù)冷的蒸餾水，高速勻漿，按照酶活和底物 1 000∶1 (U·g?1) 的比例加入動(dòng)物蛋白酶[27]，酶解液沸水浴滅活10 min，冷卻至室溫，最后以 12 000 r·min?1離心 20 min 取上清液，并對(duì)其進(jìn)行超濾分級(jí)，利用超濾裝置及3、5、10 ku超濾膜對(duì)酶解液進(jìn)行分級(jí)處理，進(jìn)口壓力控制在60 psi，得到<3、3～5、5～10和>10 ku 4個(gè)超濾組分，收集各個(gè)組分，冷凍干燥備用。

1.3.2 牡蠣酶解產(chǎn)物超濾組分的分子量分布測(cè)定 參考Li等[28]的測(cè)定方法，通過高效凝膠過濾色譜法測(cè)定牡蠣酶解超濾組分的分子量分布。使用蛋白分析色譜柱 Waters Protein-pak 60A (WAT085250)，流動(dòng)相濃度為 0.05 mol·L?1、pH 8.3的 Tris-HCl緩沖液。將洗脫速度控制在 0.7 mL·min?1，設(shè)置柱溫 25 ℃；檢測(cè)波長 214 nm，每次進(jìn)樣 20 μL。

1.3.3 牡蠣酶解產(chǎn)物超濾組分的微量金屬元素測(cè)定 銅 (Cu)、鋅 (Zn)、錳 (Mn)、硒 (Se) 微量金屬元素按照GB/T 5009.268—2016，采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 TM4細(xì)胞的培養(yǎng) TM4細(xì)胞在 D-MEM/F-12培養(yǎng)基 (體積分?jǐn)?shù)92.5%) 中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)5%馬血清和體積分?jǐn)?shù)2.5%優(yōu)質(zhì)胎牛血清，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) [體積分?jǐn)?shù)5%CO2，濕度95%]。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用胰酶消化，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 牡蠣酶解超濾組分對(duì) TM4細(xì)胞生長的影響 將 TM4細(xì)胞濃度稀釋至 1×104個(gè)·mL?1[29]，按每孔200 μL接種至96孔板，待細(xì)胞生長到融合狀態(tài)，小心吸出培養(yǎng)基，每孔加入20 μL含不同質(zhì)量濃度 (0、50、100、250、500、1 000 μg·mL?1) 的牡蠣酶解超濾組分 (<3、3～5、5～10和>10 ku)，每組設(shè)置6個(gè)平行，并分別培養(yǎng)12和24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用磷酸緩沖液 PBS配置 5 g·L?1噻唑藍(lán)(MTT) 溶液，每孔加入 20 μL MTT 溶液，并將培養(yǎng)板溫育4 h。小心吸走上清液，向每孔中加入100 μL DMSO，然后搖動(dòng) 10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)量上清液的吸光度值 (測(cè)定波長570 nm)。以不加牡蠣酶解超濾組分為空白對(duì)照組，按式 (1) 計(jì)算細(xì)胞存活率 (%)。

式中：R為細(xì)胞存活率；A0為空白對(duì)照組上清液的吸光度；A1為實(shí)驗(yàn)組上清液的吸光度。

1.3.6 TP對(duì) TM4細(xì)胞生長的影響 同 1.3.5的方法，將牡蠣酶解超濾組分換成不同濃度的TP (0、125、250、500、1 000 nmol·L?1)[13]。以不加 TP為空白對(duì)照，按式 (1) 計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.7 牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞毒性的保護(hù)作用 將 TM4細(xì)胞濃度稀釋至 1×104個(gè)·mL?1，按每孔 200 μL 接種至 96孔板，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)基，設(shè)置空白對(duì)照組(加入同等體積培養(yǎng)液)；TP 模型組 (500 nmol·L?1)；牡蠣酶解超濾組分＋TP實(shí)驗(yàn)組 (加入不同質(zhì)量濃度的牡蠣酶解超濾組分)，質(zhì)量濃度分別為50、100、250、500 μg·mL?1；細(xì)胞孵育 6 h/12 h 后小心吸出培養(yǎng)液，除空白對(duì)照組外均加入含TP的無血清培養(yǎng)液，TP終濃度為 500 nmol·L?1，于 37 ℃、含5% CO2孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用MTT法測(cè)定吸光度值，計(jì)算牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP所致TM4細(xì)胞存活率的變化量，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。

1.3.8 牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷的生化檢測(cè) 將 TM4細(xì)胞濃度稀釋至 1.5×104個(gè)·mL?1，按每個(gè) 5 mL體積接種至60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行分組。實(shí)驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度的牡蠣酶解超濾組分，質(zhì)量濃度分別為 50、100、250 μg·mL?1；空白對(duì)照組和TP模型組加入不含樣品的培養(yǎng)基，細(xì)胞孵育12 h后小心吸出培養(yǎng)液，除空白對(duì)照組外均加入含TP的無血清培養(yǎng)液，TP終濃度為500 nmol·L?1，于 37 ℃、含 5% CO2孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞經(jīng)過不同樣品和TP處理后，收集細(xì)胞進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定[30]。分別用試劑盒提供的方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH和MDA含量。通過BCA蛋白測(cè)定試劑盒確定相應(yīng)的樣品蛋白質(zhì)含量。

1.3.9 活性氧試劑盒檢測(cè) ROS的生成 將<3 ku超濾組分在不同濃度下提前與TM4細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，TP (500 nmol·L?1) 作用 TM4細(xì)胞造模 3 h[29]。細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到測(cè)定時(shí)間，按試劑盒說明將DCFHDA工作液采用無血清培養(yǎng)基稀釋，使其終濃度為10 μmol·L?1。去除含樣品的培養(yǎng)基，每孔加入DCFH-DA 稀釋液 500 μL，避光孵育 45 min。采用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞5次，2 min?次?1。細(xì)胞采用倒置熒光顯微鏡拍照并保存，同時(shí)采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞熒光值。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用 Excel 2016、Origin 2018、SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，用LSD多重比較和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析 (α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣酶解超濾組分分子量分布

超濾作為一種初步分離手段，具有操作便利、節(jié)省材料、保留樣品活性等優(yōu)點(diǎn)。分子量分布測(cè)定可有效評(píng)價(jià)超濾分級(jí)的分離效果。>10 ku超濾組分中>10 ku的成分占67.96%，<3 ku超濾組分中<3 ku的小分子物質(zhì)占57.48%，各個(gè)超濾組分中，隨著分子量的降低，<3 ku的小分子物質(zhì)占比不斷升高，>10 ku的大分子物質(zhì)占比不斷降低 (表1)，表明通過超濾分級(jí)將大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)進(jìn)行了有效分離。而在牡蠣酶解產(chǎn)物中，3～5 ku和5～10 ku 2個(gè)分子量區(qū)間的物質(zhì)占比較低，因此分離難度較大。

表1 超濾膜分級(jí)后不同分子量區(qū)間的成分占各超濾組分的比值Table 1 Ratio of different molecular mass ingredients to each ultrafiltration fraction after ultrafiltration membrane classification%

本研究選取的原料、酶解工藝和超濾分級(jí)方法均參照筆者課題組前期研究[27]，前期研究對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分的基本成分分析發(fā)現(xiàn)，牡蠣酶解粉中蛋白質(zhì) (41.26%) 和糖類 (50.07%) 為主要組成成分，而經(jīng)過超濾分級(jí)，<3 ku超濾組分的蛋白質(zhì)比例達(dá)72.3%[27]，結(jié)合分子量分布結(jié)果，說明<3 ku超濾組分中的主要成分為小分子肽和游離氨基酸。

2.2 牡蠣酶解產(chǎn)物超濾組分的微量金屬元素含量

各個(gè)牡蠣酶解超濾組分富含Cu、Zn、Mn、Se等微量金屬元素 (表2)。其中，Zn是影響男性生育的重要營養(yǎng)物質(zhì)，精漿和前列腺中均具有高濃度的Zn。精液中適量的Zn對(duì)精子產(chǎn)生與維持精子正常形態(tài)、數(shù)量、功能均至關(guān)重要[31]。此外，睪丸的發(fā)育和類固醇生成都離不開Zn的參與，在性腺功能低下、少精癥、弱精癥和無精子癥患者體內(nèi)常見Zn缺乏。牡蠣中Zn含量高于其他食物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為 61.33～616.98 mg·kg–1[32]，而<3、3～5和5～10 ku超濾組分中Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)3 019、2 998和 3 128 mg·kg–1。<3、3～5和 5～10 ku超濾組分中Cu、Zn、Mn的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于>10 ku超濾組分，說明小分子物質(zhì)與金屬元素的結(jié)合效率更高，更易富集金屬元素。本研究也發(fā)現(xiàn)，牡蠣中的Zn可與牡蠣肉中的蛋白質(zhì)和氨基酸結(jié)合，而牡蠣肉中占比較高的谷氨酸 (Glu)、亮氨酸 (Leu)、精氨酸 (Arg) 和天冬氨酸 (Asp) 表現(xiàn)出很強(qiáng)的金屬結(jié)合親和力[33]。

表2 牡蠣超濾組分微量金屬元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fractions of trace metal elements in oyster ultrafiltration fractionsmg·kg–1

2.3 牡蠣酶解超濾組分對(duì)TM4細(xì)胞生長的影響

為確保本研究中牡蠣酶解超濾組分在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)TM4細(xì)胞存活率不存在抑制作用，將細(xì)胞與各質(zhì)量濃度的牡蠣酶解超濾組分 (<3、3～5、5～10和>10 ku) 孵育 12和 24 h，通過 MTT 法測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，分別作用12和24 h后，在 1 000 μg·mL?1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白對(duì)照組相比，TM4細(xì)胞存活率均有不同程度的增加 (P<0.05，圖1)，說明各牡蠣酶解超濾組分對(duì)TM4細(xì)胞均無細(xì)胞毒性作用。

圖1 牡蠣酶解超濾組分作用于TM4細(xì)胞12 h (a) 和24 h (b) 后的細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組相比，*. 顯著差異 (P<0.05)；**. 極顯著差異 (P<0.01)。Figure 1 Cell viability of oyster hydrolyzed ultrafiltration fractions after treatment on TM4 cells for 12 h (a) and 24 h (b)Compared with the control group, *. Significant difference (P<0.05); **. Very significant difference (P<0.01).

2.4 TP對(duì)TM4細(xì)胞生長的抑制作用

已有研究表明TP具有較強(qiáng)的生殖毒性作用，而睪丸支持細(xì)胞作為維持睪丸微環(huán)境、組成血睪屏障的主要功能細(xì)胞，對(duì)有毒物質(zhì)和藥物十分敏感[13]。用不同濃度 (125、250、500和 1 000 nmol·L?1)TP處理TM4細(xì)胞24 h，隨著TP濃度增加，TM4細(xì)胞存活率呈劑量依賴性降低，與空白對(duì)照組相比，各濃度TP對(duì)TM4細(xì)胞存活率的影響均差異顯著 (P<0.05，圖2)。Wang等[13]研究也表明，TP以劑量依賴和時(shí)間依賴性的方式顯著抑制TM4細(xì)胞的生長，24 h 的 50% 抑制濃度 (IC50) 為 (669.5±269.45) nmol·L?1。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及前人[13,29-30]的研究方法，選取 500 nmol·L?1為后續(xù)造模損傷濃度。

圖2 雷公藤甲素對(duì)TM4細(xì)胞的毒性作用上標(biāo)不同字母表示具有顯著性差異 (P<0.05)；圖3—圖5同此。Figure 2 Cytotoxic effect of TP on TM4 cellsDifferent superscript letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in Figure 3?Figure 5.

2.5 牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

牡蠣酶解超濾組分分別預(yù)處理TM4細(xì)胞6和12 h，TP (500 nmol·L?1) 作用 TM4細(xì)胞 24 h 進(jìn)行毒性損傷，與TP模型組相比，牡蠣酶解超濾組分各劑量組的細(xì)胞存活率均顯著提高 (P<0.05，圖3)，說明各牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP損傷后TM4細(xì)胞的活力均具有保護(hù)作用，且呈現(xiàn)較好的劑量依賴性。其中，<3 ku 超濾組分在 250 μg·mL?1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各個(gè)劑量組的細(xì)胞存活率均具有顯著性差異 (圖 3-b)；在 250和 500 μg·mL?1作用下，<3、3～5和5～10 ku超濾組分的細(xì)胞存活率顯著高于>10 ku超濾組分 (P<0.05)，且與空白對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)，說明<3、3～5和 5～10 ku 3個(gè)超濾組分對(duì)TP損傷TM4細(xì)胞活力具有很好的保護(hù)效果，且效果優(yōu)于>10 ku超濾組分。研究表明小分子物質(zhì)更容易被機(jī)體利用和吸收，且具有更高的生物利用率和生物活性[34]，結(jié)合本研究結(jié)果，說明小分子物質(zhì)對(duì)TP損傷的TM4細(xì)胞活力具有更好的保護(hù)效果。

圖3 牡蠣超濾組分對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)TM4細(xì)胞毒性的保護(hù)作用 (預(yù)處理時(shí)間：a. 6 h；b. 12 h)Figure 3 Protective effect of oyster ultrafiltration fractions on TP-induced TM4 cytotoxicity (Pretreatment time: a. 6 h; b. 12 h)

研究表明Zn具有保護(hù)睪丸組織毒性損傷的作用，可抑制鎘、乙醇等生殖毒性物質(zhì)對(duì)生殖細(xì)胞的影響[35-36]。本研究中牡蠣酶解超濾組分中富含Zn，且<3、3～5和5～10 ku超濾組分的Zn含量高于>10 ku超濾組分，結(jié)合細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)牡蠣酶解超濾組分在改善TP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞凋亡過程中Zn可能起到了一定的協(xié)同作用。

2.6 牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的生化檢測(cè)

GSH作為一種低分子清除劑，可有效減少機(jī)體的氧化損傷，是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。TP顯著降低TM4細(xì)胞內(nèi)GSH含量，且具有劑量依賴性 (P<0.05，圖4-a)，說明TP作用于TM4細(xì)胞會(huì)降低其細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力。

各牡蠣酶解超濾組分對(duì)TM4細(xì)胞的保護(hù)效果見圖5。與TP模型組相比，不同質(zhì)量濃度 (50、100、250 μg·mL?1) 的<3 ku 超濾組分均可顯著提高TM4細(xì)胞內(nèi)GSH含量，顯著抑制TP對(duì)TM4細(xì)胞的氧化損傷且呈現(xiàn)劑量依賴性 (P<0.05)；此外，<3 ku 超濾組分 250 μg·mL?1劑量組的 GSH 含量均顯著高于其他超濾組分的各個(gè)劑量組 (P<0.05)。

自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成的終產(chǎn)物則為MDA，其水平反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度和速率，間接反映了組織過氧化損傷程度，還可影響細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，同時(shí)加劇細(xì)胞膜損傷，具有細(xì)胞毒性。與空白對(duì)照組相比，TP可顯著誘導(dǎo)TM4細(xì)胞中MDA含量的升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性 (P<0.05，圖4-b)，說明TP作用于TM4細(xì)胞會(huì)顯著增加細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度。

圖4 雷公藤甲素對(duì)TM4細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽和丙二醇含量的影響Figure 4 Effect of TP on GSH and MDA content in TM4 cells

與TP模型組相比，不同質(zhì)量濃度的各牡蠣超濾組分均不同程度地抑制TP對(duì)TM4細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷 (圖 5-b)。其中，<3 ku 和 5～10 ku 超濾組分在 100 μg·mL?1作用濃度下，抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化效果最顯著 (P<0.05)，且與空白對(duì)照組無顯著性差異，而在 50和 250 μg·mL?1質(zhì)量濃度下，<3 ku超濾組分抑制效果優(yōu)于 5～10 ku (P<0.05)。

圖5 牡蠣超濾組分對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)TM4細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽和丙二醇含量的影響Figure 5 Effect of oyster ultrafiltration fractions on GSH and MDA content in TM4 cells induced by TP

綜上，<3 ku超濾組分在各超濾組分中對(duì)TM4細(xì)胞抗氧化損傷的活性最強(qiáng)。劉姝等[37]和林海生[38]研究也表明，牡蠣酶解液中抗氧化活性物質(zhì)主要集中于<3 ku的小分子活性肽，而相關(guān)研究也表明TP主要通過誘導(dǎo)TM4細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29]，因此<3 ku超濾組分中對(duì)TP起主要拮抗作用的可能是具有抗氧化活性的小分子活性肽。

2.7 牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 是指化學(xué)性質(zhì)活潑的具有含氧基團(tuán)的化合物。有研究表明，TP對(duì)睪丸支持細(xì)胞的毒性作用機(jī)制與ROS的過量產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)的失活有關(guān)[30]。ROS的過度積累或持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TP可通過增加氧化應(yīng)激水平產(chǎn)生毒性作用。活性氧水平與細(xì)胞分化以及精子發(fā)生的生理過程密切相關(guān)，而活性氧水平的異常升高會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡，影響正常的生精過程[39]。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)GSH和MDA含量測(cè)定結(jié)果，對(duì)<3 ku超濾組分提前預(yù)處理 TM4細(xì)胞 6 h 后，TP (500 nmol·L?1) 作用 TM4細(xì)胞造模3 h，如DCFH-DA檢測(cè)所證實(shí)，在TP暴露下細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，但經(jīng)<3 ku超濾組分預(yù)處理的各個(gè)劑量組，與TP模型組相比，可顯著抑制TP誘導(dǎo)的ROS積累 (圖6和圖7)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，<3 ku超濾組分可抑制過量ROS的生成，為其減少睪丸組織的氧化損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖6 DCFH-DA探針法檢測(cè)TM4睪丸支持細(xì)胞內(nèi)活性氧 (200×)Figure 6 Intracellular ROS in TM4 Sertoli cells indicated as green fluorescence by DCFH-DA

圖7 <3 ku牡蠣超濾組分對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)TM4細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響與模型組相比，*. 顯著差異 (P<0.05)；**. 極顯著差異 (P<0.01)；與空白對(duì)照組相比，#. 顯著差異 (P<0.05)；##. 極顯著差異 (P<0.01)。Figure 7 Effect of <3 ku ultrafiltration fractions from oyster on TP-induced reactive oxygen species in TM4 cellsCompared with the model group, *. Significant difference (P<0.05);**. Very significant difference (P<0.01). Compared with the control group, #. Significant difference (P<0.05);##. Very significant difference (P<0.01).

3 結(jié)論

本研究通過TP損傷TM4細(xì)胞構(gòu)建生殖細(xì)胞損傷模型，探究了牡蠣酶解超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)的氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，<3 ku超濾組分可有效抵抗TP對(duì)TM4小鼠睪丸支持細(xì)胞的毒性損傷，提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)TM4細(xì)胞的抗氧化能力。本研究也提示小分子量的牡蠣酶解產(chǎn)物可用于抗生殖毒性損傷的保健食品利用和開發(fā)。在此基礎(chǔ)上，還有待通過動(dòng)物模型來驗(yàn)證<3 ku超濾組分對(duì)TP誘導(dǎo)的生殖損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。