童立豪，吳翔宇，黃良夫，曾 俊，石耀華，唐賢明

（1. 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院/海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571126； 2. 廣西科學(xué)院廣西紅樹(shù)林研究中心/廣西紅樹(shù)林保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海 536007； 3. 海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 ?？?570228）

瓊枝藻 (Betaphycus gelatinae) 隸屬于紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、紅翎菜科、瓊枝藻屬，俗稱瓊枝麒麟菜，主要分布于中國(guó)、菲律賓、日本、印度尼西亞等地，在中國(guó)自然分布于海南島、東沙群島和臺(tái)灣島等熱帶和亞熱帶海區(qū)[1-4]。自然界中瓊枝藻主要附著在近岸巖礁、珊瑚礁等基質(zhì)上生長(zhǎng)，藻體背、腹面顏色差異明顯，分別呈紫紅色和黃綠色，枝扁平，分枝上有疣狀突起。

作為中國(guó)海南特有土著海藻種類，瓊枝藻具有重要的生態(tài)價(jià)值及較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于食品加工、卡拉膠提取等領(lǐng)域[5-7]。研究表明，瓊枝藻藻體所含生物活性物質(zhì)具有廣譜病毒抑制[8-9]、抗凝血和抗血栓[8,10]、抗真菌[11]、抗炎癥和抗腫瘤[12]等功效，可作為醫(yī)藥開(kāi)發(fā)的良好材料。

當(dāng)前瓊枝藻野生資源極盡枯竭，呈現(xiàn)顯著萎縮的趨勢(shì)[13]，而人工養(yǎng)殖是解決原材料來(lái)源的主要途徑[14]。數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)瓊枝藻養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)下降，2018年僅 1 820 t，比 2017年 (5 629 t) 減少67.67%[15]，這與海洋生態(tài)壞境破壞、海域使用空間減少以及研究基礎(chǔ)薄弱等因素有關(guān)。我國(guó)早在1960年就開(kāi)始了瓊枝藻栽培研究，建立了較為成熟的養(yǎng)殖模式和種植技術(shù)[16]，但目前有關(guān)瓊枝藻的研究仍較少，僅有營(yíng)養(yǎng)成分[6]、卡拉膠提取[7]、藥用價(jià)值[17]、環(huán)境因子對(duì)其生長(zhǎng)的影響[14,16,18-19]等少量報(bào)道。因此，開(kāi)展相關(guān)的基礎(chǔ)研究，支撐和服務(wù)于養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展顯得尤為重要。

光是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化和形態(tài)建成等方面的重要影響因子，大型海藻在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程中，形成了不同的光適應(yīng)機(jī)制，不同種海藻對(duì)光照強(qiáng)度的需求不同。如石花菜 (Gelidium amansii)幼孢子體的適宜生長(zhǎng)光照強(qiáng)度為 2 200～4 400 lx[20]；條斑紫菜 (Porphyra yezoensis) 的適宜生長(zhǎng)光照強(qiáng)度為 6 600 lx[21]；瓦氏馬尾藻 (Sargassum vachellianum)的適宜生長(zhǎng)光照強(qiáng)度為 1 100 lx[22]。方哲等[18]以鹵鎢燈為光源研究了光照強(qiáng)度與瓊枝藻生長(zhǎng)的關(guān)系，認(rèn)為瓊枝藻在光照強(qiáng)度為3 000 lx時(shí)日生長(zhǎng)率最高。童立豪等[23]研究了光質(zhì)對(duì)瓊枝藻生長(zhǎng)和生理特性的影響，認(rèn)為紫光和藍(lán)光更有利于瓊枝藻的生長(zhǎng)。本文在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)CSE-1成像色度檢測(cè)分析系統(tǒng)，對(duì)光照強(qiáng)度與瓊枝藻生長(zhǎng)等生理指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行了量化分析和探討，以期為瓊枝藻生物學(xué)研究及人工種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

瓊枝藻取自海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院瓊海科研基地 (110°40'07.2''E、19°21'58.2''N)，挑選顏色正常、生長(zhǎng)旺盛的藻體洗凈，于自然海水中暫養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。暫養(yǎng)溫度28 ℃，鹽度28，光照強(qiáng)度5 000 lx，光周期為 12 L∶12 D。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

挑選健康無(wú)潰爛的瓊枝藻 2～3 g (濕質(zhì)量) 培養(yǎng)于 1 L 玻璃燒杯中。設(shè)置 1 000、3 000、5 000、7 000和 9 000 lx 共 5個(gè)光照強(qiáng)度，每個(gè)光照強(qiáng)度設(shè)置3個(gè)重復(fù)；采用多排密集日光燈管提供光照，通過(guò)距離遠(yuǎn)近調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。溫度、鹽度和光周期與暫養(yǎng)條件相同。每7 d換1次海水并稱質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)持續(xù) 35 d。

1.3 生長(zhǎng)速率和增重率計(jì)算

每7 d測(cè)量瓊枝藻的濕質(zhì)量，稱量前用吸水紙快速吸干藻體表層水。根據(jù)以下公式計(jì)算增重率(Weight gain rate, WGR, %) 和相對(duì)生長(zhǎng)速率 (Relative growth rate, RGR, %·d?1)：

式中：t為培養(yǎng)時(shí)間 (d)；M0為初始濕質(zhì)量(g)；Mt為 t天后的濕質(zhì)量 (g)。

1.4 色素和藻膽蛋白的提取和分析

實(shí)驗(yàn)第35天提取和分析藻體色素和藻膽蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

葉綠素 a (Chl-a) 和類胡蘿卜素 (Car) 采用無(wú)水甲醇提取法測(cè)定。根據(jù)Porra[24]的公式計(jì)算Chl-a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；根據(jù)Parsons等[25]的公式計(jì)算Car的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

藻紅蛋白 (PE) 和藻藍(lán)蛋白 (PC) 采用磷酸緩沖液提取法測(cè)定。根據(jù)Beer和Eshel[26]的公式計(jì)算PE和PC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5 顏色參數(shù)的測(cè)量與計(jì)算

實(shí)驗(yàn)第35天，用相機(jī) (佳能EOS6D，日本) 對(duì)藻體進(jìn)行無(wú)差別圖片采集，后將待測(cè)圖片導(dǎo)入CSE-1成像色度檢測(cè)分析系統(tǒng)中，隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，獲得其相應(yīng)的顏色參數(shù) L*a*b*(CIE 1976) 和三刺激值 XYZ (CIE 1931) (L*為明度，數(shù)值介于0～100，a*指紅綠色度，+ a*為紅，– a*為綠；b*指黃藍(lán)色度，+ b*為黃，– b*為藍(lán)；X、Y、Z 分別指紅、綠、藍(lán)三原色值，表示顏色的光色度特性)。計(jì)算各處理組L*a*b*和XYZ的平均值，分別作為該藻體顏色參數(shù)和三刺激值，根據(jù)下列公式計(jì)算色品坐標(biāo)x、y以及不同光照強(qiáng)度間藻體色差?Eab：

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用 Excel 2019和 SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。采用One-way ANOVA (Turkey)和t檢驗(yàn)分析顯著性差異 (P<0.05)。光照強(qiáng)度、RGR、Chl-a、Car、PE、PC與L*a*b*之間采用Pearson相關(guān)性分析 (顯著水平為P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 光照強(qiáng)度對(duì)瓊枝藻生長(zhǎng)的影響

光照強(qiáng)度為 1 000～9 000 lx 時(shí)，瓊枝藻的RGR總體上隨光照強(qiáng)度的增加而增大。光照強(qiáng)度為 1 000 lx時(shí)，瓊枝藻的 RGR 僅為 (0.12±0.01) %·d?1，遠(yuǎn)低于其他光照強(qiáng)度組；光照強(qiáng)度為7 000與9 000 lx時(shí)，RGR 達(dá)到最大 (約 1.2 %·d?1) 且無(wú)顯著差異 (P>0.05，圖 1)。

圖1 不同光照強(qiáng)度對(duì)瓊枝藻相對(duì)生長(zhǎng)速率的影響不同小寫(xiě)字母間表示差異顯著 (P<0.05)。Figure 1 Effects of different light intensities on RGR of B. gelatinaeDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

光照強(qiáng)度為1 000 lx時(shí)，瓊枝藻的WGR在實(shí)驗(yàn)期間無(wú)明顯增加；其余各處理組生長(zhǎng)變化趨勢(shì)基本一致，實(shí)驗(yàn)前14 d生長(zhǎng)較緩慢，第14—21天增長(zhǎng)較明顯，之后趨于穩(wěn)定，WGR均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升。光照強(qiáng)度 7 000和 9 000 lx組的增重率變化曲線基本重合 (圖2)。

圖2 不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻增重率隨時(shí)間的變化Figure 2 Change of WGR for B. gelatinae at different light intensities along with time

2.2 光照強(qiáng)度對(duì)瓊枝藻光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

隨著光照強(qiáng)度的增加，瓊枝藻的Chl-a質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸下降。光照強(qiáng)度 1 000和 3 000 lx組的 Chl-a質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于 9 000 lx 組 (P<0.05)，其余處理組間無(wú)顯著差異 (P>0.05)。光照強(qiáng)度 9 000 lx 組的Car質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于 3 000 lx 組 (P<0.05)，其余處理組間無(wú)顯著差異 (P>0.05)，且 1 000、5 000和 7 000 lx組的 Car質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本一致 (圖 3)。

圖3 不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻的色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同小寫(xiě)字母間表示差異顯著 (P<0.05)；不同大寫(xiě)字母間表示差異顯著 (P<0.05)；圖4同此。Figure 3 Pigment mass fraction of B. gelatinae at different light intensitiesDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).Different capital letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in Figure 4.

光照強(qiáng)度為1 000 lx時(shí)，瓊枝藻的PE質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他處理組 (P<0.05)，且隨光照強(qiáng)度的增加逐漸下降，光照強(qiáng)度3 000 lx組的PE質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于 5 000、7 000和 9 000 lx 處理組 (P<0.05)，后3個(gè)處理組間均無(wú)顯著差異 (P>0.05)。各光照強(qiáng)度下的PC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，1 000 lx組較其他組高且差異顯著 (P<0.05，圖4)。

圖4 不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻的藻膽蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 4 Phycobiliprotein mass fraction of B. gelatinae at different light intensities

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)瓊枝藻顏色的影響

實(shí)驗(yàn)材料初始顏色均為紅褐色。經(jīng)35 d實(shí)驗(yàn)后，光照強(qiáng)度1 000 lx下瓊枝藻顏色未發(fā)生變化，仍呈紅褐色，與實(shí)驗(yàn)前藻體顏色無(wú)明顯差異；光照強(qiáng)度3 000和5 000 lx下瓊枝藻顏色呈淺紅色，并逐漸偏向綠色；而光照強(qiáng)度7 000和9 000 lx下瓊枝藻的顏色無(wú)明顯差異，均為綠色 (圖5)。

圖5 不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻的顏色變化Figure 5 Color change of B. gelatinae at different light intensities

本研究顯示，經(jīng)35 d實(shí)驗(yàn)后，顏色均一的瓊枝藻隨光照強(qiáng)度的增加L*和b*總體上呈增大趨勢(shì)，而a*則呈顯著減小趨勢(shì) (表1)。L*介于26.14～50.64，光照強(qiáng)度為 9 000 lx時(shí)，L*最大；光照強(qiáng)度為 1 000 lx時(shí)，L*最小。a*介于?10.28～28.24，光照強(qiáng)度為 7 000和 9 000 lx時(shí)，色度均為綠色 (?a*)；其余光照強(qiáng)度下，色度為紅色 (+a*)。b*介于12.49～34.25，各處理組的色度均為黃色 (+b*)；光照強(qiáng)度為 1 000 lx 時(shí)b*最小，光照強(qiáng)度為 7 000 lx 時(shí)b*最大。

表1 不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻的明度、紅綠色度和黃藍(lán)色度Table 1 L＊a＊b＊ values of B. gelatinae at different light intensities

不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻顏色的三刺激值XYZ集中在CIE 1931色度圖上x(chóng)為0.354～0.519、y為0.313～0.471。光照強(qiáng)度為1 000 lx時(shí)，主要分布在紅原色區(qū)域，偏暗紅色；光照強(qiáng)度為3 000和5 000 lx時(shí)分布在紅原色和綠原色過(guò)渡區(qū)，偏向黃色；光照強(qiáng)度為7 000和9 000 lx時(shí)則主要分布在綠原色區(qū)域，偏亮綠色 (圖6)。

圖6 不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻的顏色色度圖分布Figure 6 Distribution of XYZ on CIE color diagram for B. gelatinum at different light intensities

不同光照強(qiáng)度下各處理組間瓊枝藻顏色的色差?Eab最小為11.22，最大為50.57，且隨光照強(qiáng)度差異的增大而增加 (表2)。

表2 不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻顏色的色差?EabTable 2 ?Eab values of B. gelatinae at different light intensities

2.4 瓊枝藻顏色變化與光照強(qiáng)度、生長(zhǎng)、光合色素的相關(guān)性

光照強(qiáng)度與L*呈顯著正相關(guān) (R=0.922,P<0.05)，與a*呈極顯著負(fù)相關(guān) (R=?0.997,P<0.01)。RGR 與L*呈顯著正相關(guān) (R=0.933,P<0.05)，與b*呈極顯著正相關(guān) (R=0.968，P<0.01)。Chl-a與L*呈顯著負(fù)相關(guān) (R=?0.883,P<0.05)，但與a*呈顯著正相關(guān) (R=0.952,P<0.05)；Car 與顏色參數(shù)L*a*b*均無(wú)顯著相關(guān)性。PE和PC均僅與a*呈顯著正相關(guān) (P<0.05，表 3)。

表3 瓊枝藻的顏色參數(shù) (明度、紅綠色度、黃藍(lán)色度) 與光照強(qiáng)度、相對(duì)生長(zhǎng)速率、光合色素的相關(guān)性Table 3 Correlation between L＊a＊b＊ values with light intensity, RGR and photosynthetic pigment

3 討論

3.1 瓊枝藻生長(zhǎng)對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)

植物通過(guò)光合作用合成有機(jī)物，滿足自身生長(zhǎng)的能量需要，而光照強(qiáng)度直接影響植物的光合生長(zhǎng)，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，不同植物對(duì)光照強(qiáng)度有著不同的適應(yīng)機(jī)制[27-28]。光照強(qiáng)度過(guò)低時(shí)會(huì)導(dǎo)致光合作用不足，影響藻類植物的正常生長(zhǎng)，過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致藻體產(chǎn)生過(guò)多的單線態(tài)氧 (1O2)，破壞藻體的光合色素和光合組織結(jié)構(gòu)，最終影響其正常生長(zhǎng)[29-31]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)心卡帕藻 (Kappaphycus alvarezii) 綠色品系和紅色品系對(duì)光照強(qiáng)度的需求差異明顯，最適生長(zhǎng)光照強(qiáng)度分別為 8 300和 1 600 lx[32]；真江蘺 (Gracilaria verrucosa) 隨光照強(qiáng)度的增大生長(zhǎng)速率逐漸增加，當(dāng)光照強(qiáng)度為5 000 lx時(shí)生長(zhǎng)速率最高[33]；芋根江蘺 (G. blodgettii) 的最適生長(zhǎng)光照強(qiáng)度為9 000 lx[34]。本研究中瓊枝藻的生長(zhǎng)速率隨光照強(qiáng)度的增加而增大，當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到5 000 lx后生長(zhǎng)速率沒(méi)有顯著增加，表明瓊枝藻在5 000～9 000 lx光照強(qiáng)度下均能快速生長(zhǎng)。方哲等[18]研究顯示光照強(qiáng)度為3 000 lx時(shí)，瓊枝藻的日生長(zhǎng)速率最高。造成這種差異的原因，可能是由于實(shí)驗(yàn)條件如材料處理、溫度、鹽度、光質(zhì)等不同所致。方哲等[18]的研究用鹵鎢燈作為光源，而本研究以日光燈為光源，這也可能會(huì)影響同一光照強(qiáng)度下藻體的生長(zhǎng)速率。

3.2 瓊枝藻光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)

紅藻植物光合色素主要由Chl-a和藻膽蛋白組成，藻膽蛋白主要包括PE、PC和別藻藍(lán)蛋白[35]。Chl-a和藻膽蛋白是光合作用的反應(yīng)中心和捕光系統(tǒng)，藻膽蛋白捕獲光能并傳遞給光系統(tǒng)Ⅱ，光能依次通過(guò)PE、PC、別藻藍(lán)蛋白傳遞至Chl-a[36]。Chl-a和藻膽蛋白受環(huán)境因子尤其是光照強(qiáng)度的影響，在一定范圍內(nèi)，隨著光照強(qiáng)度的增加，Chl-a、藻膽蛋白的含量下降[37]。本研究符合這一規(guī)律，經(jīng)35 d培養(yǎng)后瓊枝藻在低光照強(qiáng)度條件下Chl-a、類胡蘿卜素和藻膽蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，并隨著光照強(qiáng)度的增加而逐漸下降，這可能是瓊枝藻應(yīng)對(duì)不同光照強(qiáng)度的一種自我調(diào)節(jié)，通過(guò)增加光合色素含量，使其在光照強(qiáng)度不足時(shí)提高光能利用率，盡可能地滿足自身生長(zhǎng)對(duì)能量的需要。在方哲等[18]的研究中，Chl-a和藻膽蛋白含量總體變化與本研究相似，但其Chl-a含量顯著低于本研究，而藻膽蛋白尤其是PE含量卻遠(yuǎn)高于本研究，這種差異可能是由實(shí)驗(yàn)材料處理方法和實(shí)驗(yàn)光源不同造成，也可能是提取方法不同所致。

3.3 光照強(qiáng)度對(duì)瓊枝藻顏色的影響及相關(guān)性分析

經(jīng)35 d培養(yǎng)，肉眼觀察和三刺激值XYZ在CIE 1931色度圖中的散點(diǎn)圖分析均顯示，隨著光照強(qiáng)度的增加，瓊枝藻由紅原色經(jīng)黃色而最終趨于綠原色，光照強(qiáng)度對(duì)藻體的顏色有顯著影響，與方哲等[18]的研究描述基本一致。本文采用顏色參數(shù)L*a*b*和CIE 1931色度圖分析，更精準(zhǔn)地體現(xiàn)了顏色差異與光照強(qiáng)度的關(guān)系。相關(guān)性分析顯示，光照強(qiáng)度與L*呈顯著正相關(guān)，而與a*呈極顯著負(fù)相關(guān)；RGR與L*、b*均呈顯著正相關(guān)；藻體顏色參數(shù)變化與光照強(qiáng)度、RGR具有較強(qiáng)的相關(guān)性和規(guī)律性，可通過(guò)測(cè)定藻體的顏色參數(shù)值來(lái)分析和判斷藻體的生長(zhǎng)狀況，具有一定的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。顏色是色素等呈色物質(zhì)的種類、數(shù)量和分布的綜合體現(xiàn)，使植物顯現(xiàn)出不同顏色[38-39]，這既與物種的遺傳組成有關(guān)，也受光照等環(huán)境因子的影響[40]。瓊枝藻的色素和藻膽蛋白含量變化可能是其在不同光照強(qiáng)度下呈現(xiàn)出不同顏色的重要因素。本研究顯示，不同光照強(qiáng)度下瓊枝藻顏色參數(shù)L*a*b*與Chl-a以及藻膽蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著相關(guān)，表觀顏色的變化是瓊枝藻內(nèi)部色素作用的結(jié)果，通過(guò)對(duì)藻體顏色參數(shù)分析，可對(duì)藻體內(nèi)在色素的組成、含量等作出一定的判斷。