陽智芬 鄒彬彬 曹麗群 謝毓濱

新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜（neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura，NAITP） 是新生兒血小板減少中較為常見的一種，在初生嬰兒中發(fā)病率約為1/800～1/1 000[1]。NAITP的發(fā)病機(jī)制與新生兒溶血類似，胎兒遺傳自父親的血小板抗原能夠刺激母體產(chǎn)生抗血小板抗體，該IgG型抗體能通過胎盤進(jìn)入胎兒血液循環(huán)與相應(yīng)的血小板結(jié)合，致敏血小板被巨噬細(xì)胞吞噬而導(dǎo)致血小板減少[2]。本研究采用血小板抗體檢測和基因分析，對1例NAITP患兒及母親血小板抗體特異性及血小板抗原進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

材料與方法

1 病例 患兒，女，于2020年3月20日出生。其母無輸血史，孕2產(chǎn)1，血小板計數(shù)為204×109/L。女嬰出生時無瘀點(diǎn)瘀斑，出生后第一天、第二天、第四天血小板計數(shù)分別為99×109/L、78×109/L、83×109/L。臨床疑似為NAITP而送檢。

2 儀器與試劑 Ion Gene StudioTMS5二代測序儀（賽默飛世爾科技，美國）、GBOX凝膠成像儀（Syngene，美國）、A24811 PCR儀（賽默飛世爾科技，美國）、洗板機(jī)（Tecan，瑞士）、Epoch酶標(biāo)儀（BioTek，美國）、電泳儀（北京六一）、PlateSpinⅡ平板離心機(jī)（久保田，日本）、孵育箱（上海圣科），Luminex200（Luminex，美國）。全血基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技公司，批號S8111）、AllType? NGS HLA分型試劑（賽默飛世爾科技，批號2149057）血小板抗體檢測試劑盒（長春博德，批號20191005）、PAKPLUS血小板抗體特異性分析試劑盒（美國Immucor公司，批號3008388）、人類血小板同種抗原HPA1-18，21試劑盒（PCR-SSP法）（天津秀鵬公司，批號K201911004），LIFECODES LSA試劑盒（美國Immucor公司，批號3009479）。

3 方法

3.1 血小板抗體篩查：采用固相凝集法，嚴(yán)格按說明書要求操作，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，陽性：指示紅細(xì)胞均勻平鋪于反應(yīng)孔底部表面；弱陽性：指示紅細(xì)胞結(jié)合區(qū)域大于陰性對照; 陰性：指示紅細(xì)胞聚集于反應(yīng)孔底部中央形成紅細(xì)胞聚集。

3.2 血小板抗體特異性分析：嚴(yán)格按照說明書步驟操作，結(jié)果判斷：Cut-off=NCOD×cut-off Multiplier，OD值≥Cutoff 值則判為陽性。

3.3 HLA-I類特異性抗體檢測：利用Luminex平臺檢測， 嚴(yán)格按LIFECODES LSA試劑盒說明書操作。

3.4 HPA基因分型：按照人類血小板同種抗原HPA1-18，21基因分型試劑盒（PCR-SSP法）說明書操作，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，在2.5%瓊脂糖凝膠中150V電泳12 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍攝成像。

3.5 HLA基因測序：提取好的DNA使用AllType? NGS HLA分型試劑按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫制備、模板制備，在Ion GeneStudioTMS5測序平臺上進(jìn)行二代測序，測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用TSV軟件進(jìn)行分析。

3.6 實(shí)驗(yàn)室診斷流程 見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)室診斷流程圖

結(jié) 果

1 血小板抗體篩查 采用固相凝集法對患兒及母親血清進(jìn)行血小板抗體篩查，結(jié)果顯示，患兒血小板抗體為陰性，母親血小板抗體為陽性。

2 血小板抗體特異性分析 其母親血清經(jīng)血小板特異性抗體檢測分析，結(jié)果為HPA特異性抗體陰性，HLA抗體陽性。經(jīng)Luminex進(jìn)一步的免疫抗體分析，結(jié)果顯示該抗體為抗HLA-B60抗體和HLA-Cw7抗體。

3 血小板抗原HPA基因分型 患兒及母親血小板HPA基因分型電泳圖分別見圖2A和圖2B，HPA基因分型結(jié)果見表1。

表1 患兒及母親HPA基因分型結(jié)果

圖2 患兒（A）和母親（B）血小板特異性抗原（HPA1-18，21）基因分型電泳圖（PCR-SSP）

4 HLA基因測序 患兒及母親HLA基因測序結(jié)果見表2，結(jié)果顯示，HLA-A*2402、B*4001和C*0702所編碼的抗原可能是導(dǎo)致該例NAITP的抗原。

表2 患兒及母親HLA基因測序結(jié)果

討 論

NAITP的臨床表現(xiàn)主要為血小板減少，可出現(xiàn)瘀點(diǎn)瘀斑，嚴(yán)重時可出現(xiàn)內(nèi)臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血。胎兒血小板抗原在妊娠16周后開始表達(dá)，血小板抗體在孕14周可進(jìn)入胎盤，因此該病在第一胎時就可發(fā)生，其嚴(yán)重程度與母親的孕產(chǎn)史和抗體類型密切相關(guān)。NAITP的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，目前實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括血小板計數(shù)、血小板抗體檢查、血小板抗原基因分型[3]等，本例患兒出生后三次血常規(guī)檢測均顯示血小板計數(shù)＜100×109/L，無其他血小板減少的臨床表現(xiàn)，其母親血小板計數(shù)為240×109/L，血小板抗體篩查陽性，進(jìn)一步確定為抗HLAB60抗體和HLA-Cw7抗體，結(jié)合患兒HLA基因分型，可診斷為NAITP。本例中患兒血小板抗體篩查結(jié)果為陰性，可能是由于患兒體內(nèi)大多數(shù)血小板抗體已與自身血小板結(jié)合，血清中游離的血小板抗體濃度較低，因此血小板抗體篩查呈陰性。

血小板表面主要表達(dá)兩類抗原，一類是血小板特異性抗原（human platelet antigens，HPA），一類是血小板相關(guān)抗原，如HLA-I類抗原和ABH抗原。在已報道的NAITP病例中，大部分是由HPA抗體所致，在高加索人群中，80%的NAITP是由抗-HPA-1a引起的，其次為抗-HPA-5a（15%），日本人NAITP的發(fā)生主要與HPA-5b（75%）有關(guān)，其次為HPA-4b[4]。不同種族人群遺傳背景不同，HPA遺傳多態(tài)性分布具有一定的差異性，目前還未有大數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析導(dǎo)致我國人群NAITP的主要HPA抗體類型，只有一些零星的個例報道。國內(nèi)周燕等先后報道了一例由HPA-5b引發(fā)的NAITP[5]和一例由抗HPA-3a所致的NAITP[6]。此外，近期有研究在胎兒血清中檢測出抗CD36抗體，表明抗CD36也可以導(dǎo)致NAITP[7]。

早期有學(xué)者認(rèn)為抗HLA抗體不會引起NAITP，原因是HLA抗原在胎兒組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，抗HLA抗體大部分與胎兒其他細(xì)胞反應(yīng)而不只是血小板[8]。隨著研究的深入，研究者相繼報道了HPA-3a抗體和HLA-Bw6抗體共同引起的NAITP[9]以及HPA-15b抗體和HLA-I類抗體共同引起的NAITP[10]。后續(xù)又有報道分析了四例與母源性HLA抗體相關(guān)的NAITP，涉及的HLA抗體有抗-HLA-A11、抗-HLAA2、 抗-HLA-B40、抗-HLA-B15、抗-HLA-B7和抗-HLAB27[11]。在本病例中，抗體特異性分析結(jié)果顯示患兒母親HPA特異性抗體陰性，HLA抗體陽性，基因檢測結(jié)果顯示，患兒HPA基因分型為HPA-（1-14，16-18，21）aa-15ab，患兒母親HPA基因分型為HPA-（1-4，6-14，16-18，21）aa-5ab-15ab，可見該病例中HPA抗原不是引起NAITP的原因。HLA基因測序結(jié)果顯示，患兒擁有HLA-A*24：02、B* 40：01和C* 07：02三個與母親不同的等位基因，其對應(yīng)的抗原分別為A24、B60和Cw7，這三種HLA抗原可能會刺激母親產(chǎn)生相應(yīng)抗體。HLA抗體特異性分析結(jié)果顯示，抗A24抗體未檢出，抗B60和抗Cw7抗體呈強(qiáng)陽性。因此結(jié)合HLA抗體檢測和基因分型結(jié)果可確定該病例為由抗HLA-B60抗體和抗HLA-Cw7抗體引起的NAITP。有研究表明，妊娠次數(shù)與HLA抗體具有一定的相關(guān)性，隨著妊娠次數(shù)的增加，HLA抗體陽性率呈上升趨勢[12]。HLA抗體誘導(dǎo)的NAITP與抗體效價有密切關(guān)系，但這類抗體影響胎兒血小板的具體機(jī)制還不明確，有待進(jìn)一步深入研究[13]。

母親血清中存在針對胎兒血小板抗原的抗體是導(dǎo)致NAITP的主要因素，因此孕期血小板抗體篩查對預(yù)防NAITP十分重要。對臨床上疑似NAITP胎兒，應(yīng)進(jìn)行血小板抗體特異性分析和HPA/HLA基因檢測，在考慮HPA 抗體同時，應(yīng)重視HLA 抗體的因素。

致謝感謝博富瑞公司為該項目實(shí)驗(yàn)提供的支持

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