尹鍶瑤，吳伯梅，鮮思美,2*,包濤濤，3，楊 倩，張 友，顧慶林，梁 倩，龍婷婷，周 飄，李召仁

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究所，貴陽 550025；3.貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州黔東南 556000)

我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，畜牧業(yè)占據(jù)重要地位，并逐漸由傳統(tǒng)的散養(yǎng)轉(zhuǎn)向集約化及規(guī)?；l(fā)展，但不可忽視的是其也帶來了嚴(yán)峻的環(huán)境污染[1]。集約化養(yǎng)殖場排放的污染物中含有大量病原微生物、寄生蟲和孳生蚊蠅，從而致使畜禽傳染病和寄生蟲病蔓延，最終嚴(yán)重危害人畜生命健康[2-3]。養(yǎng)鴨業(yè)作為我國畜牧業(yè)主要支柱之一，甚是如此，通過菌落總數(shù)的測定可以有效了解養(yǎng)殖場環(huán)境微生物情況。消毒能夠清除或殺滅病原微生物，降低病原的感染和疫病的爆發(fā)，是預(yù)防疫病的重要措施[4-5]。為了解市場上現(xiàn)常用的消毒劑對養(yǎng)殖場的消毒效果，本試驗通過對貴州省某舍飼鴨場空氣、糞便、墊料、飲水進(jìn)行菌落總數(shù)測定，并結(jié)合現(xiàn)有研究選用配制5種消毒劑[6]，對鴨場空氣、漏縫地板、料槽、蛋框、運輸車車輪和鴨蹼部皮膚進(jìn)行現(xiàn)場消毒試驗，采集消毒前后鴨場環(huán)境及鴨蹼部皮膚樣本進(jìn)行菌落總數(shù)測定，為養(yǎng)殖場制定消毒規(guī)程及防控細(xì)菌性疾病提供依據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 超凈工作臺(蘇州金靜凈化設(shè)備科技有限公司)；冰箱(海爾集團(tuán))；高壓蒸汽滅菌鍋：LDZM-80L-II(上海申安醫(yī)療器械廠)；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(德國BINDER公司)；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、磷酸氫二鉀、卵磷脂、TWEEN-80、甘氨酸、硫代硫酸鈉等試劑(北京TIANGEN公司)；聚維酮碘溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液(河南后裔實業(yè)集團(tuán)有限公司)；苯扎溴銨溶液(江西鵬創(chuàng)生物科技有限公司)；月芐三甲氯銨溶液(西鄉(xiāng)長江動物藥品有限責(zé)任公司)；復(fù)方戊二醛(英國考文垂化學(xué)藥品有限公司)。中和劑和最小殺菌濃度的消毒劑參照吳伯梅[6]等文獻(xiàn)配制(表1)

表1 中和劑和最小殺菌濃度的消毒劑Tab 1 Neutralizer and disinfectants with minimal bactericidal concentration

1.2 舍飼鴨場基本情況 該鴨場飼養(yǎng)模式為舍飼，品種為金定蛋鴨，主要為90日齡大小。共計10個舍飼大棚，每個舍飼大棚800～1200 m2，現(xiàn)存欄量共計4萬多羽。每個舍飼大棚中，鴨的主要休息區(qū)及產(chǎn)蛋區(qū)占五分之四，鋪設(shè)墊料，鴨的活動區(qū)占五分之一，為漏縫地板，水線高漏縫地板距離為30 cm左右。

1.3 舍飼鴨場環(huán)境微生物菌落的檢測與分析 參照GB/T 18204.3-2013公共場所衛(wèi)生檢驗方法，采用自然沉降法對鴨場空氣進(jìn)行采樣。按梅花布點設(shè)置5個采樣點，距離墻壁1 m以上，距地面1.2～1.5 m，避開通風(fēng)處。于5個采樣點分別放置2個營養(yǎng)瓊脂平板，打開皿蓋暴露5 min進(jìn)行采樣。將采集細(xì)菌后的營養(yǎng)瓊脂平板置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)。

選擇3個鴨存欄量最高的舍飼大棚，隨機(jī)采集鴨棚前部、中部及后部鴨糞便各10份，每30份為一個樣本。墊料采樣同糞便。水樣參照GB/T 5750.12-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法，對用一大棚的水箱進(jìn)行采集與保存。

空氣細(xì)菌總數(shù)參照張鶴平[7]介紹的奧氏公式 C=50000×每皿菌落數(shù)/(平皿面積×采樣持續(xù)時間)進(jìn)行統(tǒng)計。糞便、墊料及飲水細(xì)菌總數(shù)參照GB 4789.2-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中的檢測方法進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4 五種消毒劑對鴨場進(jìn)行現(xiàn)場消毒試驗

1.4.1 采樣 參照GB/T 18204.3-2013公共場所衛(wèi)生檢驗方法，對消毒前后的鴨場空氣進(jìn)行采樣，按梅花布點設(shè)置5個采樣點。每個采樣點于消毒前放置2個營養(yǎng)瓊脂平板采樣5 min，利用鴨場自帶的霧線進(jìn)行4種消毒劑的噴霧消毒，消毒30 min后，放置2個營養(yǎng)瓊脂平板采樣5 min。將消毒前后的營養(yǎng)瓊脂平板于實驗室37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落總數(shù)測定。

參照DB11/T 1429-2017動物養(yǎng)殖場消毒效果評價規(guī)范，對消毒前后的漏縫地板、料槽、蛋框及運輸車車輪進(jìn)行采樣。每處設(shè)置4個采樣點，分別使用4種消毒劑進(jìn)行噴灑消毒，采樣面積取10×10 cm2，于消毒處理前后15 min進(jìn)行采樣。采樣時用蘸取適量滅菌生理鹽水的棉拭子在取樣范圍內(nèi)橫、豎各5次滾動涂抹取樣，無菌操作放入裝有含10 mL相應(yīng)無菌中和劑的滅菌生理鹽水試管中，塞緊試管，標(biāo)記并記錄。旋渦振蕩混勻樣品，做10倍系列倍比稀釋，選擇適宜稀釋度，取0.5 mL混合液于滅菌平皿，作平行樣，用傾注法倒入培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)48 h，計算樣品平均菌落數(shù)。

遵循隨機(jī)采樣原則，抽取6只鴨，鴨左蹼皮膚使用無菌棉拭子均勻涂抹進(jìn)行消毒前采樣，鴨右蹼皮膚使用稀釋后的聚維酮碘均勻涂抹，5 min后使用無菌棉拭子進(jìn)行消毒后采樣。

1.4.2 菌落總數(shù)統(tǒng)計 參照張鶴平[7]介紹的奧氏公式C=50000×每皿菌落數(shù)/(平皿面積×采樣持續(xù)時間)，統(tǒng)計消毒前后空氣中每立方米的細(xì)菌總數(shù)。參照GB 4789.2-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗，統(tǒng)計消毒前后菌落總數(shù)測定漏縫地板、料槽、蛋框、運輸車車輪及鴨蹼部皮膚每平方米的細(xì)菌總數(shù)。

1.4.3 殺菌率的計算 參照DB11/T 1429-2017動物養(yǎng)殖場消毒效果評價規(guī)范，根據(jù)消毒前后樣品平均菌落數(shù)計算殺菌率。殺菌率的計算公式為：殺菌率=(消毒前樣本平均菌數(shù)-消毒后樣本平均菌數(shù))/消毒前樣本平均菌數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨場空氣、糞便、墊料及飲水中的菌落總數(shù)測定結(jié)果 對采集自鴨場環(huán)境中的空氣、糞便、墊料及飲水的樣本進(jìn)行菌落總數(shù)測定，結(jié)果見表2。由表可知，舍飼鴨場空氣菌落總數(shù)為3.79×104CFU/m3，超出NY/T 388-1999畜禽場環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定數(shù)值(25000 CFU/m3)；糞便菌落總數(shù)為2.67×107CFU/g，超出GB18596-2001畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定數(shù)值(1.03×106CFU/g)；墊料菌落總數(shù)為3.7×106CFU/g，超出NY/T1167-2006畜禽場環(huán)境質(zhì)量及衛(wèi)生控制規(guī)范規(guī)定的清潔土壤數(shù)值(5×104CFU/g)；飲水菌落總數(shù)為12 CFU/mL，符合GB 5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(100 CFU/mL)。

表2 鴨場空氣、糞便、墊料及飲水菌落總數(shù)測定結(jié)果Tab 2 The results of the determination of thetotal number of bacteria in the air, feces, paddingand drinking water of the duck farm

2.2 空氣、漏縫地板、料槽、蛋框、運輸車車輪消毒前后結(jié)果 消毒劑對鴨場空氣漏縫地板、料槽、蛋框、運輸車車輪消毒前后結(jié)果分別見表3，表4，表5，表6，表7。由表可知，鴨場空氣菌落總數(shù)范圍消毒前為(2.81～4.09)×104CFU/m3，消毒后為(2.47～2.94)×104CFU/m3，戊二醛癸甲溴銨對空氣的殺菌率最高，為34.85%；鴨場漏縫地板菌落總數(shù)范圍消毒前為(4.68～23.7)×109CFU/m2，消毒后為(0.203～2.37)×109CFU/m2，復(fù)方戊二醛對漏縫地板的殺菌率最高，為96.78%；鴨場料槽菌落總數(shù)范圍消毒前為(6.02～34.2)×107CFU/m2，消毒后為(1.84～17.3)×107CFU/m2，戊二醛癸甲溴銨對料槽的殺菌率最高，為74.35%。鴨場蛋框菌落總數(shù)范圍消毒前為(4.67～34.6)×104CFU/m2，消毒后為(2.5～6.47)×104CFU/m2，復(fù)方戊二醛對蛋框的殺菌率最高，為81.31%；鴨場運輸車車輪菌落總數(shù)范圍消毒前為(3.47～51.9)×104CFU/m2，消毒后為(0.43～11.53)×104CFU/m2，戊二醛癸甲溴銨對運輸車車輪的殺菌率最高，為85.86%。

表3 空氣消毒前后菌落計數(shù)Tab 3 Colony count before and after air disinfection

表4 漏縫地板消毒前后菌落計數(shù)Tab 4 Colony count before and after disinfection of slatted floor

表5 料槽消毒前后菌落計數(shù)Tab 5 Colony count before and after disinfection of feed trough

表6 蛋框消毒前后菌落計數(shù)Tab 6 Colony count before and afterdisinfection of egg box

表7 運輸車車輪消毒前后菌落計數(shù)Tab 7 Colony count before and after disinfectionof transporter wheels

2.3 聚維酮碘對鴨蹼部皮膚消毒前后結(jié)果 通過聚維酮碘對鴨蹼部皮膚進(jìn)行消毒，結(jié)果見表8。由表可知，鴨蹼部皮膚菌落總數(shù)消毒前為(1.49±1.76)×107CFU/m2，消毒后為(0.41±0.56)×107CFU/m2，聚維酮碘對鴨蹼部皮膚細(xì)菌殺菌率為72.45%。

表8 聚維酮碘對鴨蹼部皮膚消毒前后菌落計數(shù)Tab 8 Colony count of povidone iodine before andafter disinfection of the skin of duck webs

3 討論與結(jié)論

舍飼鴨場空氣菌落總數(shù)為3.79×104CFU/m3，超出NY/T 388-1999畜禽場環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定數(shù)值(25000 CFU/m3)，王光鋒[8]等研究中鴨場空氣菌落總數(shù)為3921 CFU/m3，本研究與其相差近十倍，原因可能與糞便和墊料有關(guān)；糞便菌落總數(shù)為2.67×107CFU/g， 超出GB18596-2001畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定數(shù)值(1.03×106CFU/g)，可能是畜禽糞便含有大量微生物，且存活時間長導(dǎo)致[9]；墊料菌落總數(shù)為3.7×106CFU/g，超出了NY/T1167-2006畜禽場環(huán)境質(zhì)量及衛(wèi)生控制規(guī)范規(guī)定的清潔土壤數(shù)值(5×104CFU/g)，可能是墊料被鴨的糞尿污染，又未定時更換干燥潔凈的墊料導(dǎo)致。陳亮[10]等指出鴨舍空氣細(xì)菌與墊料細(xì)菌含量呈正相關(guān)，鴨糞便分解會使帶有微生物的粉塵污染空氣[11]，多種因素導(dǎo)致鴨場空氣菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)。本研究結(jié)果表明，該舍飼鴨場存在大量超過國標(biāo)菌落總數(shù)的安全隱患，環(huán)境污染問題十分嚴(yán)峻。

配制五種消毒劑對鴨場進(jìn)行現(xiàn)場消毒的試驗中，四種消毒劑對空氣的消毒作用均不理想，按照GB27948-2011空氣消毒劑衛(wèi)生要求，消毒劑對空氣中自然菌的殺菌率應(yīng)≥90.0%，原因可能與消毒方法有關(guān)，國內(nèi)學(xué)者談書勤[12]等在關(guān)于空氣消毒技術(shù)研究中提出了多種空氣消毒的觀點，生產(chǎn)中可考慮多種空氣消毒的方法。臧一天[13]等研究表明噴霧消毒比人工消毒效果更好，該鴨場霧線消毒設(shè)施的老舊損壞可能也是原因之一。在對漏縫地板、料槽、蛋框、運輸車車輪的消毒試驗中，消毒后菌落標(biāo)準(zhǔn)偏差小，殺菌率高，消毒均勻且效果良好。其中復(fù)方戊二醛和戊二醛癸甲溴銨消毒效果較好，這兩者都是戊二醛與季銨鹽的一種復(fù)配。這種復(fù)配充分發(fā)揮兩者的殺菌效果，能夠有效地殺滅大腸埃希氏桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌[14]，而這些細(xì)菌則是引起幾種鴨主要細(xì)菌病的病原菌[15～17]。生產(chǎn)中通過這種復(fù)配聯(lián)合用藥的方式，可使得消毒劑的消殺效率顯著提升。聚維酮碘對鴨蹼部皮膚的消毒效果不理想。吳蕾[18]等研究中10%聚維酮碘溶液稀釋至0.5%反應(yīng)30 min殺菌率可達(dá)100%，本試驗中聚維酮碘溶液作用時間僅為5 min，時間的不足可能導(dǎo)致殺菌效果不理想。周慶民[19]等試驗表明pH、光線和儲存方式等多種因素會影響聚維酮碘溶液的穩(wěn)定性，本試驗中的聚維酮碘溶液可能因保存不當(dāng)表現(xiàn)出低的殺菌效果。在實際的養(yǎng)殖過程中，聚維酮碘親和皮膚、黏膜且無毒性，可以外用對受傷、脫肛的鴨進(jìn)行消毒處理后再進(jìn)行治療[20]。

消毒是疾病綜合防治的一個重要環(huán)節(jié)，在規(guī)模化養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中，消毒的效果通常還受消毒模式、消毒方式、消毒劑種類、消毒劑濃度及消毒時間等多種因素影響[21-23]。因此，在實際養(yǎng)殖過程中，應(yīng)該始終秉持“預(yù)防為主，治療為輔”的原則，根據(jù)養(yǎng)殖場自身情況，制定合適合理的消毒程序。對該鴨場來說，建議加強(qiáng)管理，定時更換干凈的墊料，及時清理糞尿污物，使用有效消毒設(shè)施，選擇合理消毒藥物，輪換用藥，定期消毒，預(yù)防細(xì)菌性疾病，保障動物及人員健康。