張英楠，徐 晶，張桂山，楊樹寶 , 3*

(1. 吉林醫(yī)藥學院， 吉林吉林 132013；2. 長春科技學院，長春 130600；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118)

刺五加多糖(ASPS)是從刺五加根莖中分離出的免疫活性多糖，具有調(diào)節(jié)動物免疫機能、抗氧化、抗腫瘤和抗感染等功效[1-2]。結(jié)合刺五加的功效及其安全、綠色和環(huán)保的特點，將其應用于養(yǎng)殖過程中具有重要意義。

T淋巴細胞主要介導細胞免疫，機體在抗原刺激下，通過致敏和反應階段，T淋巴細胞分化為效應性T淋巴細胞并產(chǎn)生各種細胞因子，從而抵抗體內(nèi)外各種病原菌的感染[3]。T淋巴細胞兩個重要的表面標志是CD4和CD8，其中CD4+T淋巴細胞的主要功能是分泌細胞因子，具有誘導和增強免疫應答的作用，CD8+T淋巴細胞主要介導細胞毒殺傷作用。CD4+和CD8+T淋巴細胞是機體免疫調(diào)節(jié)的樞紐，在正常值范圍內(nèi)當CD4+/CD8+值高時，表明機體處于高的免疫狀態(tài)，當CD4+/CD8+的比例失調(diào)或缺陷時，可導致各種免疫疾病發(fā)生[4]。

研究證明，植物多糖能夠促進T淋巴細胞的增殖，尤其是對于維持CD4+/CD8+值的正常范圍具有重要作用[5-7]。另外，這些研究主要是通過流式細胞術(shù)對血液中的淋巴細胞亞群數(shù)量變化進行檢測，而目前關(guān)于ASPS對雞T淋巴細胞亞群定位分布的影響還未見報道。因此本研究利用免疫組織化學方法檢測ASPS對雞脾臟中CD4+和CD8+T淋巴細胞定位分布的影響，從組織學角度觀察ASPS對脾臟的免疫調(diào)節(jié)作用，為進一步探討ASPS的免疫功能調(diào)節(jié)機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 200只1日齡海蘭褐公雛，購自長春市農(nóng)業(yè)科學研究院種雞場。

1.2 主要試劑及儀器 刺五加多糖由本實驗提取和純化，多糖純度為 81%[8]；冰凍切片用OCT組織包埋液：美國Sakura公司產(chǎn)品；小鼠抗雞CD4、CD8單克隆抗體：美國Southern Biotechnology公司產(chǎn)品；Ultra Sensitive SP超敏試劑盒kit 9901：福州邁新公司產(chǎn)品。

Leica CM1850 冰凍切片機：德國Leica公司生產(chǎn)；Olympus CX41 顯微鏡：日本Olympus公司生產(chǎn)；Pixera pro150ES圖像采集器：美國Pixera公司生產(chǎn)。

1.3 動物分組與處理 1日齡海蘭褐公雛飼養(yǎng)至7日齡時選取150只，隨機分為3組，每組50只。第1組和第2組為ASPS低劑量組和高劑量組，分別用ASPSL和ASPSH表示，兩組分別皮下注射100 mg/mL和200 mg/mL的ASPS；第3組為空白對照組，注射等量滅菌生理鹽水。所有組每天注射1次，ASPS和生理鹽水均為0.2 mL，連續(xù)注射3 d。

每一組分別在最后一次注射ASPS后的第7、14、21和28天取材，每組分別隨機選取10只雛雞，快速取其脾臟。將脾臟制成冰凍切片，片厚5 μm，-80 ℃保存?zhèn)溆?，以進行免疫組織化學染色。

1. 4 免疫組織化學染色程序 每組每只雞隨機選取5張切片，每張切片依次滴加30 mL/L過氧化氫(室溫下孵育10 min)、小鼠抗雞CD4(1∶200)或CD8(1∶200)單克隆抗體工作液(37 ℃孵育1 h)、聚合物增強劑(室溫下孵育20 min)和酶標抗鼠/兔聚合物(室溫下孵育30 min)；每一種試劑孵育后，均用PBS洗3次，每次3 min；最后DAB顯色；蘇木精復染；自來水沖洗返藍；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹脂封片；照相。

1. 5 圖像分析及統(tǒng)計學處理 應用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測定脾臟中單位視野內(nèi)陽性細胞面積。每張切片測3個視野，取平均值。應用SPSS18.0軟件對各組陽性細胞進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD4+T淋巴細胞定位分布的變化情況

圖1- A，B，C，D顯示，空白對照組隨著日齡增長，脾臟中CD4+T淋巴細胞的數(shù)量逐漸增加，除免疫后7 d明顯低于其他日齡外，其他各日齡之間差異不明顯，各日齡CD4+T淋巴細胞主要分布在動脈周圍淋巴鞘中，其他部位以散在形式存在。

免疫后7 d和14 d時ASPSL組和ASPSH組CD4+T淋巴細胞的數(shù)量均有所增加，但與空白對照組比較差異并不顯著(P>0.05)，而免疫后21 d和28 d時顯著增加(P<0.05)(圖2)。從免疫后14 d開始，主要由CD4+T淋巴細胞構(gòu)成的動脈周圍淋巴鞘面積較空白對照組明顯增加，尤其是免疫后21 d和28 d時，單個動脈周圍淋巴鞘面積大概是同日齡對照組的3倍左右(圖1-G，H)，但是此階段紅髓中CD4+T淋巴細胞較同日齡對照組和同組之前日齡明顯減少(圖1-G，H)。

2.2 CD8+T淋巴細胞定位分布的變化情況

圖1- I，J，K，L顯示，各組各日齡CD8+T淋巴細胞都主要分布在紅髓和白髓中，動脈周圍淋巴鞘中較少，沒有較大面積的由CD8+T淋巴細胞構(gòu)成的動脈周圍淋巴鞘出現(xiàn)，空白對照組陽性細胞的數(shù)量免疫后7 d和14 d變化較小，但是免疫后21 d時明顯增加。

與對照組比較，除了免疫后28 d ASPSH組CD8+T淋巴細胞數(shù)量顯著增加外(P<0.05)，其他各日齡ASPSL組和ASPSH組CD8+T淋巴細胞雖有所增加，但是差異均不顯著(P>0.05)(圖2)，而且CD8+T淋巴細胞的定位分布與同日齡對照組比較也無大的變化，陽性細胞都主要分布在紅髓和白髓中，而動脈周圍淋巴鞘中陽性細胞較少(圖1-M，N，O，P)。

2.3 CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的變化情況 表1顯示，免疫后7 d和14 d時，ASPSL組和ASPSH組CD4+/CD8+T淋巴細胞比值與空白對照組比較差異不顯著(P>0.05)。免疫后21 d和28 d時，ASPSL組和ASPSH組CD4+/CD8+T淋巴細胞比值為1.1左右，均顯著高于空白對照組(P<0.05)，但兩個ASPS組之間比較差異并不顯著(P>0.05)。

表1 各組雞CD4+/CD8+T淋巴細胞亞群比值的動態(tài)變化Tab 1 The dynamic changes of the rario of CD4+/CD8+T lymphocytes in different groups

圖A-D分別顯示免疫后7、14、21和28 d空白對照組CD4+ T淋巴細胞分布；圖E-H分別顯示免疫后7、14、21和28 dASPSH組CD4+ T淋巴細胞分布；圖I-L分別顯示免疫后7、14、21和28 d空白對照組CD8+ T淋巴細胞分布；圖M-P分別顯示免疫后7、14、21和28天ASPSH組CD8+ T淋巴細胞分布注：圖中細箭頭所示為動脈周圍淋巴鞘，粗箭頭所示為紅髓中陽性細胞A-D are respectively the distribution of CD4+ cells in control group of 7, 14, 21 and 28 days after immunization; E-H are respectively thedistribution of CD4+ cells in ASPSH group of 7, 14, 21 and 28 days after immunization; I-L are respectively the distribution of CD8+ cells incontrol group of 7,14, 21 and 28 days after immunization; M-P are respectively the distribution of CD8+ cells in ASPSH group of 7, 14, 21 and28 days after immunizationNote: The thin arrows indicate PALS, while the thick arrows indicate positive cells in the red pulp圖1 ASPS對脾臟中CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞定位分布的影響(250×)Fig 1 The effect of ASPS on distribution of CD4+and CD8+T lymphocytes in spleen (250×)

注：同一日齡肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)Different letters of shoulder label indicated significant difference (P<0.05), while the same letter ofshoulder label indicated no significant difference (P>0.05).圖2 ASPS對脾臟中CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞數(shù)量的影響Fig 2 The effect of ASPS on quantity of CD4+ and CD8+T lymphocytes in spleen

3 討論與結(jié)論

T、B淋巴細胞是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的主要細胞群體，分別調(diào)節(jié)機體的細胞和體液免疫應答, 是適應性免疫系統(tǒng)的主要效應細胞。多糖能調(diào)節(jié)T、B細胞周期，刺激其分裂增殖，并促進相關(guān)細胞因子和抗體的分泌[8]。ASPS可激活NK(自然殺傷) 細胞和巨噬細胞，并對T、B細胞產(chǎn)生重要作用，從而增強機體的免疫功能[9]。Lee等[10]還發(fā)現(xiàn), 刺五加多糖能夠與TLR4受體以及CD14結(jié)合，進一步激活NF-κB信號通路，促進IL-1β，IL-6，IL-10和TNF-α的產(chǎn)生。Han等人[11]發(fā)現(xiàn)，ASPS能夠與與TLR2或TLR4相互作用，能夠激活小鼠的免疫細胞如巨噬細胞和B細胞，并且進一步活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB、MAPK，然后調(diào)節(jié)免疫細胞產(chǎn)生各種細胞因子如TNF-α，IL-6，iNOS等，從而進一步調(diào)節(jié)免疫反應。目前多糖對T淋巴細胞免疫功能的調(diào)節(jié)主要通過檢測淋巴細胞增殖能力以及相關(guān)細胞因子等方法進行的，另外對T淋巴細胞亞群的觀察主要是利用流式細胞術(shù)對數(shù)量進行檢測，但是關(guān)于多糖對CD4+和CD8+T淋巴細胞在免疫器官及組織中的精確定位變化還未見報道，這對于進一步揭示多糖的免疫調(diào)節(jié)機制具有重要意義。

脾臟作為雞體內(nèi)的最大的外周免疫器官對T依賴性抗原產(chǎn)生體液免疫應答是通過動脈周圍淋巴鞘和橢球周圍淋巴鞘之間的相互作用誘導產(chǎn)生的[12]。本文前期研究證明ASPS能夠明顯促進由CD3+T淋巴細胞構(gòu)成的動脈周圍淋巴鞘和由Bu-1+B淋巴細胞過程的橢球周圍淋巴鞘的發(fā)育[8]。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細胞是構(gòu)成動脈周圍淋巴鞘的主要T淋巴細胞亞群，與對照組比較，ASPSL組和ASPSH組位于紅髓和白髓中散在的CD4+T淋巴細胞減少，而動脈周圍淋巴鞘中CD4+T淋巴細胞的數(shù)量顯著增多，從而使動脈周圍淋巴鞘的面積明顯增加。這說明在ASPS作用下，CD4+T淋巴細胞在脾臟中發(fā)生遷移，主要募集到動脈周圍淋巴鞘周圍，并進一步增殖，具體原因和機理還需要以后進一步研究。由于CD4+細胞可以產(chǎn)生各種細胞因子，參與或協(xié)助細胞和體液免疫反應，ASPS能夠促進脾臟中CD4+細胞的數(shù)量增加，另外影響其在脾臟的定位分布，都是增強免疫的表現(xiàn)。

研究同時發(fā)現(xiàn)，ASPS對脾臟中CD8+T淋巴細胞的數(shù)量以及定位分布影響較小，與對照組比較無明顯變化。另外，免疫后21和28天時，與空白對照組比較，ASPS能夠顯著提高CD4+/CD8+T淋巴細胞比值(P<0.05)。因此在ASPS作用下，脾臟中CD4+T淋巴細胞增多以及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值升高，證明脾臟免疫功能得到進一步提高。這也與其他學者利用流式細胞術(shù)對T淋巴細胞亞群檢測的結(jié)果基本一致：邱妍等[13]的試驗發(fā)現(xiàn)，合適劑量的黃芪、板藍根、牛膝和山藥等4種多糖均可以促進雞CD4+T淋巴細胞增殖，從而增強細胞免疫。此外，雞CD4+T 淋巴細胞還具有輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的作用，從而提高體液免疫。王宏軍等[14]試驗發(fā)現(xiàn)貴州南五味子多糖明顯促進正常雞體內(nèi)T淋巴細胞增殖，CD4+細胞百分比升高，CD8+細胞百分比下降，CD4+/CD8+細胞比值升高。Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)川明參多糖能夠提高環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的CD4+/CD8+細胞比值，使其比值恢復至正常水平。因此，中藥多糖對于改善和維持T淋巴細胞亞群的正常范圍具有重要作用。

ASPS雖然對脾臟中CD8+T淋巴細胞的數(shù)量和分布無明顯影響，但對CD4+T淋巴細胞的定位分布影響較大，能夠促進紅髓中CD4+T淋巴細胞向動脈周圍淋巴鞘遷移，使動脈周圍淋巴鞘面積增加，這從組織學角度證明ASPS能夠通過影響CD4+T淋巴細胞的定位分布發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。