李 勝, 何 建, 辛有全, 楊曉艷, 靳 娟, 張 琪, 楊建國(guó), 熊浩明, 柏吉祥, 代瑞霞

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌(簡(jiǎn)稱鼠疫菌)引起的一種自然疫源性疾病，是以發(fā)病急、傳播快、病死率高、傳染性強(qiáng)為特征的烈性傳染病，在我國(guó)傳染病防治法中被列為甲類管理的傳染病。鼠疫在世界歷史上曾有多次大流行，死亡人數(shù)近2億[1]，近年來(lái)，世界范圍內(nèi)的鼠疫疫情進(jìn)入活躍態(tài)勢(shì)，我國(guó)的鼠疫疫情也呈明顯上升趨勢(shì)[2-4]。鼠疫不僅嚴(yán)重影響著人類的健康,而且鼠疫菌是一種能夠通過(guò)呼吸道傳播的烈性生物恐怖病原,會(huì)對(duì)國(guó)家安全、社會(huì)和諧與經(jīng)濟(jì)發(fā)展構(gòu)成巨大威脅[5-6]。目前，氨基糖甙類抗生素中的鏈霉素是WHO推薦治療鼠疫的特效藥物，特別是針對(duì)肺鼠疫。國(guó)外，馬達(dá)加斯加2株耐藥鼠疫菌的發(fā)現(xiàn)，引起了全球的高度關(guān)注，其中1株為攜帶8種耐藥基因的多重耐藥菌株[7-8]，其對(duì)鏈霉素、磺胺類等多種抗菌藥物表現(xiàn)出高抗性。耐藥鼠疫菌株的出現(xiàn)，使鼠疫防控形勢(shì)變得更加嚴(yán)峻，使篩選對(duì)鼠疫菌敏感的新型抗菌藥物的任務(wù)變得更加緊迫。美國(guó)FDA分別于2012年和2015年批準(zhǔn)將左氧氟沙星和莫西沙星用于鼠疫的預(yù)防和治療[9-10]。目前，我國(guó)以左氧氟沙星和莫西沙星作為鼠疫推薦用藥尚缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為系統(tǒng)評(píng)價(jià)這兩種藥物對(duì)我國(guó)鼠疫菌的敏感性，本研究通過(guò)治療實(shí)驗(yàn)感染的豚鼠鼠疫來(lái)評(píng)價(jià)這兩種抗菌藥物的療效，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)豚鼠30只(雌性)，體重250～300 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司西安分公司提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(青)2016-0001)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基 鼠疫菌強(qiáng)毒株141株，赫氏培養(yǎng)基均由青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 藥物 注射用甲磺酸左氧氟沙星(0.2 g/支)，由山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051882。鹽酸莫西沙星注射液(20 mL∶0.4 g)，由成都天臺(tái)山制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20140125。

1.1.4 主要設(shè)備 動(dòng)物負(fù)壓隔離籠購(gòu)自意大利泰尼百斯公司，II級(jí)B2型生物安全柜購(gòu)自賽默飛世爾公司，動(dòng)物換籠工作臺(tái)購(gòu)自美國(guó)紐埃爾公司。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)豚鼠共30只，隨機(jī)分成3組，1組用用左氧氟沙星治療，1組用莫西沙治療，對(duì)照組1組，實(shí)驗(yàn)前編號(hào)、稱重。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)感染 取強(qiáng)毒鼠疫菌141株37 ℃ 24 h培養(yǎng)，用滅菌生理鹽水制備成菌懸液，比濁稀釋為1×107cfu/mL。鼠鼷部皮下注射于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每只注射1 mL。本實(shí)驗(yàn)操作均在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。

1.2.3 藥物治療 左氧氟沙星和莫西沙星用量具體參照《中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典》成人劑量，用施新猷[11]的動(dòng)物折算系數(shù)法，換算成豚鼠每日每公斤體重用藥劑量，其中左氧氟沙星為40 mg/(kg·d)，每只豚鼠給藥：12 mg/d；莫西沙星為32 mg/(kg·d)，每只豚鼠給藥：9.6 mg/d。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物感染鼠疫菌24 h后分別用左氧氟沙星和莫西沙星進(jìn)行皮下注射給藥，連續(xù)用藥9 d后停藥，經(jīng)醫(yī)學(xué)觀察9 d后處死，解剖取臟器進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。對(duì)照組不治療。

1.2.4 結(jié)果判定 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別用莫西沙星和左氧氟沙星持續(xù)治療9 d，再醫(yī)學(xué)觀察9 d后處死，解剖取臟器28 ℃培養(yǎng)24～48 h后，若各臟器中未分離到鼠疫菌，可視為治愈。若治療期間動(dòng)物死亡，并從臟器中分離到鼠疫菌為治療無(wú)效，屬特異性死亡。

2 結(jié) 果

2.1 療效觀察 表1結(jié)果顯示，左氧氟沙星組和莫西沙星組治療實(shí)驗(yàn)感染鼠疫的豚鼠全部存活，治愈率均為100%，對(duì)照組動(dòng)物于感染鼠疫菌后3～5 d全部死亡。見(jiàn)表1。

表1 左氧氟沙星、莫西沙星治療豚鼠實(shí)驗(yàn)感染鼠疫的療效觀察Tab.1 Observation of therapeutic effects of levofloxacin and moxifloxacin in the treatment of guinea pigs experimentally infected with Yersinia pestis

2.2 豚鼠實(shí)驗(yàn)感染鼠疫后的結(jié)果觀察 豚鼠于感染鼠疫菌的第1 d開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)豎立、納食及飲水量明顯減少、體形卷曲、活動(dòng)量明顯減少等現(xiàn)象。對(duì)照組豚鼠于感染后3～5 d全部死亡，解剖可見(jiàn)鼠鼷部淋巴結(jié)明顯腫大，皮下充血，肝、脾充血腫大，呈典型的鼠疫病理改變；取肝、脾、肺、心等臟器進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，均分離到鼠疫菌，為特異性死亡。實(shí)驗(yàn)組豚鼠于感染鼠疫菌24 h后開(kāi)始藥物治療，持續(xù)用藥9 d后，精神狀態(tài)明顯改善，納食、飲水、運(yùn)動(dòng)量逐漸恢復(fù)正常。停藥后醫(yī)學(xué)觀察9 d，動(dòng)物各方面狀況良好。處死解剖觀察各臟器無(wú)明顯病理改變，經(jīng)鼠疫細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。

3 討 論

近年來(lái)，隨著自然疫源地不斷擴(kuò)大、全球化進(jìn)展等，鼠疫仍威脅著全球公共衛(wèi)生安全。目前，鼠疫臨床治療仍以鏈霉素為首選，但其安全范圍較窄，具有明顯的耳毒性和腎毒性。近年來(lái)，國(guó)際不斷有耐藥鼠疫菌株的報(bào)道[12]，國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)我國(guó)不同鼠疫疫源地分離的鼠疫菌進(jìn)行了抗生素的敏感性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠疫菌對(duì)傳統(tǒng)治療藥物的敏感性有所下降[13-14]，這使鼠疫傳統(tǒng)治療方案面臨新的挑戰(zhàn)。因此篩選一種新型、高效、低毒的抗菌藥物將成為未來(lái)鼠疫治療研究的重要方向。

左氧氟沙星和莫西沙星都屬于喹諾酮類抗菌藥物，主要通過(guò)抑制細(xì)菌內(nèi)部的遺傳物質(zhì)DNA旋轉(zhuǎn)酶(細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ)的合成，阻止細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。本研究中，實(shí)驗(yàn)組豚鼠感染鼠疫菌24 h后分別用左氧氟沙星和莫西沙星進(jìn)行皮下注射給藥，連續(xù)用藥9 d后，停藥觀察9 d，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活，存活率為100%。將存活動(dòng)物處死后，解剖取臟器進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。對(duì)照組豚鼠于感染后3～5 d全部死亡，解剖可見(jiàn)鼠鼷部淋巴結(jié)明顯腫大，皮下充血，肝、脾充血腫大，呈典型的鼠疫病理改變；取各臟器進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，均分離到鼠疫菌，為特異性死亡。豚鼠對(duì)鼠疫菌的敏感性高，戴瑞霞等[15]在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)鼠疫菌敏感性實(shí)驗(yàn)比較中，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒鼠疫菌141株對(duì)豚鼠最小致死量(MLD)為50個(gè)菌，本次實(shí)驗(yàn)豚鼠的攻擊劑量為1×107cfu/mL，相差20萬(wàn)倍，感染24 h后開(kāi)始治療，存活率為100%，這就說(shuō)明了左氧氟沙星和莫西沙星對(duì)急性期鼠疫感染均有效。這一結(jié)果與辛有全等[16]對(duì)鼠疫菌體外抑菌活性研究結(jié)果相同。因此，今后可考慮將左氧氟沙星和莫西沙星做為治療鼠疫的備選藥物，以備在出現(xiàn)鼠疫耐藥菌株或鏈霉素過(guò)敏反應(yīng)等應(yīng)急情況時(shí)發(fā)揮重要作用。