劉 丹，烏蘭圖雅，殷旭紅，崔云虹，王亭富，阿木日汗，曹民治，王國(guó)棟，閆大成,李純浦,高娃

蜱媒傳染病是由蜱作為傳播媒介而引發(fā)的一類自然疫源性疾病。蜱是一種吸血寄生蟲(chóng)，它不但可以游離存活在自然界內(nèi)，還可以寄生于牛、羊、馬、駱駝、鼠等動(dòng)物體內(nèi)或體表。蜱可感染、傳播的病原體種類多、范圍廣，而且一種蜱可同時(shí)攜帶2種或2種以上的病原體[1]。許多病原體能經(jīng)卵、經(jīng)期傳遞，使蜱成為貯存宿主和傳播媒介。近年來(lái)，蜱媒傳染病暴發(fā)在世界各地頻發(fā)，嚴(yán)重影響到畜牧業(yè)的發(fā)展，給居民的健康帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2-4]。

內(nèi)蒙古東部大興安嶺林區(qū)位于中國(guó)東北部，與俄羅斯相鄰，擁有我國(guó)最大的天然草原區(qū)，作為我國(guó)重要的林牧業(yè)基地之一，植被覆蓋率較高。得天獨(dú)厚的自然環(huán)境，使得野生動(dòng)物資源豐富，加之大量家畜牧養(yǎng)，促進(jìn)了蜱的生長(zhǎng)、繁殖。既往研究曾從內(nèi)蒙古東部草原的蜱樣本中檢出多種病原體[5-6]。牙克石段作為大興安嶺林區(qū)的重要組成部分，人的蜱傳萊姆病和森林腦炎發(fā)病率較高，近年又在該地發(fā)現(xiàn)另一種蜱傳疾病——埃立克體病，其在牙克石地區(qū)發(fā)病率為14.77%[7]。本研究在大興安嶺林區(qū)牙克石段采集蜱樣本，分析大興安嶺林區(qū)牙克石段的蜱種、蜱攜帶病原體種類及復(fù)合感染，為該地區(qū)預(yù)防和控制蜱傳病原體感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域 大興安嶺林區(qū)牙克石段即牙克石市，它是呼倫貝爾市下轄13個(gè)縣級(jí)市之一，位于內(nèi)蒙古東北部(北緯47°39′～50°21′，東經(jīng)120°28′～122°29′)、大興安嶺中脊中段西坡。市域沿大興安嶺主脈南北分布，平均海拔600余米，屬大陸性寒溫帶氣候特征，年平均氣溫-1 ℃～-5 ℃。野生動(dòng)物資源豐富，因而使其成為蜱類棲息的良好孳生地。

1.2 標(biāo)本采集與分類 2016-2019年，在東部林區(qū)蜱活躍高峰期(5-6月)采用布旗法采集游離蜱標(biāo)本，記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)、方法、寄主等信息。

1.3 蜱蟲(chóng)的解剖和DNA提取 采集到的蜱蟲(chóng)標(biāo)本使用次磷酸鈉和75%的乙醇加碘伏，浸泡5 min，消毒后用無(wú)菌水清洗自然干燥。利用體視顯微鏡逐一進(jìn)行解剖，摘出唾液腺保存于PBS溶液，并使用QIAamp DNA Mini Kit進(jìn)行DNA提取，按照說(shuō)明書(shū)操作，提取出來(lái)的DNA保存于-20 ℃。

1.4 蜱種的分類與鑒定 將采集到的標(biāo)本使用體視顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)初分類。然后對(duì)蜱DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)得的DNA片段測(cè)序，最后通過(guò)在線BLAST將測(cè)得DNA序列與GenBank基因序列比對(duì)來(lái)確定蜱的種類。

1.5 特異性基因分析 采用靈敏度和特異度較高的靶基因檢測(cè)蜱中可能存在的多種病原體。斑點(diǎn)熱立克次體的檢測(cè)先采用gltA基因進(jìn)行初篩，將gltA初篩陽(yáng)性樣品分類，再選擇代表性樣品擴(kuò)增合rOmpA基因進(jìn)行確認(rèn)。埃立克體屬以omp1、無(wú)形體屬以msp2、萊姆病螺旋體以flaB、新型回歸熱螺旋體以glpQ作為靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系均使用Blend Tag-Plus，按照說(shuō)明書(shū)操作。PCR擴(kuò)增中使用的各種特異性引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成，見(jiàn)表1。

表1 特異性PCR引物設(shè)計(jì)Tab.1 Specific PCR primer design

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)來(lái)描述，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同地區(qū)常見(jiàn)蜱種及所處生態(tài)景觀分布 大興安嶺林區(qū)牙克石段共采集蜱蟲(chóng)2 786只，雄蜱1 413只(50.7%)，雌蜱1 373只(49.3%)；幼蜱83只(3.0%)，若蜱125只(4.5%)，成蜱2 578只(92.5%)。通過(guò)體視顯微鏡觀察和基因分析，隸屬于1科3屬4種，分別為全溝硬蜱2 191只(78.6%)、嗜群血蜱442只(15.9%)、日本血蜱133只(4.8%)、森林革蜱20只(0.7%)，全溝硬蜱、嗜群血蜱為本地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種。其中，全溝硬蜱分布于所有地區(qū)，嗜群血蜱和日本血蜱的分布也較廣泛，森林革蜱僅在3個(gè)地區(qū)分布。在所調(diào)查的區(qū)域內(nèi)，常見(jiàn)生境均以原始的棕色針葉森林為主，僅烏奴耳鎮(zhèn)(70.6%，211/299)和綽河源鎮(zhèn)(51.1%，95/186)以嗜群血蜱居多之外，其他地區(qū)均以全溝硬蜱居多，見(jiàn)表2。

表2 牙克石市不同地理區(qū)劃中常見(jiàn)蜱種所處生態(tài)景觀分布Tab.2 Ecological landscape distribution of common tick species in geographic divisions of Yakeshi City

2.2 不同地區(qū)蜱攜帶病原體種類 在大興安嶺林區(qū)牙克石段的7個(gè)采樣地區(qū)的蜱中，斑點(diǎn)熱立克次體檢出率較高的為烏奴耳鎮(zhèn)和綽河源鎮(zhèn)，分別為74.2%(222/299)和48.4%(90/186)；無(wú)形體屬檢出率較高的有博克圖鎮(zhèn)(18.9%，39/206)、免渡河鎮(zhèn)(14.6%，183/1 256)、烏奴耳鎮(zhèn)(13.0%，39/299)和烏爾其漢鎮(zhèn)(10.8%，72/669)；埃立克體屬檢出率較高的為庫(kù)都爾鎮(zhèn)和免渡河鎮(zhèn)，分別為26.1%(12/46)和13.1%(164/1 256)；萊姆病螺旋體總檢出率為42.9%(1 195/2 786)，其中庫(kù)都爾鎮(zhèn)(76.1%，35/46)、博克圖鎮(zhèn)(54.9%，113/206)、烏奴耳鎮(zhèn)(49.8%，149/299)和免渡河鎮(zhèn)(44.7%，561/1 256)的檢出率均超過(guò)平均水平；新型回歸熱螺旋體的檢出率較高的為庫(kù)都爾鎮(zhèn)和烏奴耳鎮(zhèn)，分別為13.0%(6/46)和10.0%(30/299)，見(jiàn)表3。

表3 不同地區(qū)蜱攜帶病原體情況Tab.3 Pathogens carried by ticks in different regions

2.3 不同特征蜱攜帶病原體情況 在檢出的4種蜱中，斑點(diǎn)熱立克次體檢出率最高的蜱種為嗜群血蜱(66.5%，294/442)，檢出率最低的為全溝硬蜱(2.8%，61/2 191)(χ2=993.756，P<0.001)；無(wú)形體屬檢出率較高的為全溝硬蜱(13.5%，296/2 191)和嗜群血蜱(10.4%，46/442)，森林革蜱未檢出無(wú)形體(χ2=27.679，P<0.001)；埃立克體屬檢出率最高的為全溝硬蜱(11.2%，245/2 191)，森林革蜱未檢出埃立克體(χ2=17.586，P<0.001)；萊姆病螺旋體檢出率較高的為全溝硬蜱(44.6%，977/2 191)和嗜群血蜱(42.3%，187/442)(χ2=34.895，P<0.001)；新型回歸熱螺旋體檢出率較高的是森林革蜱，為(10.0%，2/20)，日本血蜱未檢出該病原體(χ2=21.814，P<0.001)，見(jiàn)表4。

成蜱的無(wú)形體屬檢出率(13.2%)高于若蜱(3.2%)(χ2=23.149,P<0.001)；成蜱的萊姆病螺旋體檢出率(44.3%)高于幼蜱(7.2%)(χ2=46.606，P<0.001)，成蜱、若蜱、幼蜱的新型回歸熱螺旋體檢出率分別為5.1%、4.8%、1.2%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.61，P=0.271)。見(jiàn)表4。

表4 不同特征蜱攜帶病原體情況Tab.4 Pathogens carried by ticks with different characteristics

2.4 不同地區(qū)蜱攜病原體的復(fù)合感染 大興安嶺林區(qū)牙克石段蜱的復(fù)合感染率為19.5%(544/2 786)。雙重復(fù)合感染率為16.4%(458/2 786)，其中斑點(diǎn)熱立克次體和萊姆病螺旋體復(fù)合感染率最高，為7.1%(197/2 786)。蜱的雙重復(fù)合感染率最高的地區(qū)是免渡河鎮(zhèn)，為40.6%(186/458)；伊圖里河鎮(zhèn)最低，為1.3%(6/458)。蜱的多重復(fù)合率為3.1%(86/2 786)。烏奴耳鎮(zhèn)是3種病原體復(fù)合感染率最高的地區(qū)，為47.4%(36/76)。僅烏奴耳鎮(zhèn)(90%，9/10)和綽河源鎮(zhèn)(10%，1/10)的蜱存在4種病原體的復(fù)合感染，見(jiàn)圖1。

圖1 不同地區(qū)復(fù)合感染率構(gòu)成Fig.1 Composition of multiple infections in different regions

3 討 論

大興安嶺林區(qū)牙克石段地處內(nèi)蒙古東部大興安嶺林區(qū)中心區(qū)域，有豐富的蜱資源，且蜱叮咬事件和蜱媒萊姆病或森林腦炎在該地區(qū)發(fā)生較多。但是，由于缺乏認(rèn)識(shí)，使得一些被蜱叮咬的發(fā)熱病例得不到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)，誤診及漏診十分普遍，因此研究該地區(qū)蜱攜病原體感染狀況十分必要。

全溝硬蜱在內(nèi)蒙古東部林區(qū)的分布最為廣泛，生境主要是棕色針葉森林，為該地區(qū)主要的優(yōu)勢(shì)蜱種，與秦文浩等[7]的研究結(jié)果相似。全溝硬蜱在北方針闊混交林帶大量分布，在我國(guó)的新疆、內(nèi)蒙古以及東北3省、河北省北部等地區(qū)均為優(yōu)勢(shì)蜱種[11-13]。

本次PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，大興安嶺林區(qū)牙克石段蜱的萊姆病螺旋體感染率相對(duì)較高，與萬(wàn)康林等[14]的研究結(jié)果相似。不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)蜱攜帶病原體差異較大。烏奴耳鎮(zhèn)蜱的斑點(diǎn)熱立克次體和無(wú)形體的感染率相對(duì)較高，而庫(kù)都爾鎮(zhèn)蜱的埃立克體、萊姆病螺旋體和新型回歸熱螺旋體的感染率相對(duì)較高。因此，要因地制宜，根據(jù)不同地區(qū)蜱攜病原體的種類和水平制定相應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施。

不同蜱種攜帶的蜱媒病原體差異很大。嗜群血蜱的斑點(diǎn)熱立克次體感染率相對(duì)較高，與吳瓊等[15]的研究結(jié)果一致；全溝硬蜱的無(wú)形體、埃立克體和萊姆病螺旋體的感染率相對(duì)較高；森林革蜱的新回歸熱螺旋體感染率較高，這可能與蜱種及其宿主的特異性相互作用有關(guān)，也可能是病原體感染敏感性存在蜱種屬特異性[6]。本研究顯示雄性蜱攜帶病原體高于雌性，與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果一致[16-17]。另外，成蜱的病原體感染率高于幼蜱。這可能是由于多數(shù)蜱類在其發(fā)育期間需要更換宿主，成蟲(chóng)被病原體感染幾率高于幼蟲(chóng)。另外，某些病原菌可經(jīng)卵傳播，蜱可以將病原菌傳遞給下一代，而無(wú)形體和埃立克體例外，二者均不能垂直傳播，故幼蜱中檢測(cè)不到該病原體。

大興安嶺林區(qū)牙克石段的蜱攜多種病原體復(fù)合感染率為19.5%，高于俄羅斯某地報(bào)道(12.4%)[18]。以往發(fā)表的文獻(xiàn)已證實(shí)，復(fù)合感染在萊姆病中多見(jiàn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，蜱的萊姆病螺旋體和斑點(diǎn)熱立克次體復(fù)合感染率為7.1%，同時(shí)萊姆病螺旋體和埃立克體或無(wú)形體復(fù)合感染率均為5.3%，介于以往美國(guó)調(diào)查結(jié)果(3%～26%)[20-21]。病原體復(fù)合感染在全溝硬蜱中較普遍，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均在全溝硬蜱中同時(shí)檢測(cè)到2種或以上的病原體[12-13,22-23]，本研究顯示全溝硬蜱復(fù)合2種及以上病原體的感染率為14.6%(319/2 191)。全溝硬蜱是典型的3宿主蜱，完成一個(gè)生命周期需經(jīng)過(guò)卵、幼蜱、若蜱和成蜱4個(gè)不同的階段[5]。全溝硬蜱自卵孵化后，一般需要多次更換宿主才能完成飽血過(guò)程，這極大地增加了該蜱被脊椎動(dòng)物攜帶的幾率，也增加了其攜帶病原體的種類。免渡河鎮(zhèn)和烏奴耳鎮(zhèn)的蜱普遍攜帶多種病原體，需重點(diǎn)加強(qiáng)該地區(qū)蜱媒傳染病的監(jiān)測(cè)和預(yù)防。

本研究所采集的東部林區(qū)范圍相對(duì)較窄，較為局限。此外，僅用布旗法采集了林區(qū)的游離蜱，缺乏不同采集方法及不同宿主對(duì)蜱種及分布特征影響等方面的資料。在后續(xù)的研究中，我們會(huì)逐漸擴(kuò)大樣本采集范圍、增加不同寄生宿主蜱的采集，更深入的挖掘不同宿主、不同生境對(duì)蜱攜病菌種類的影響。另一方面，我們?cè)诓≡w的進(jìn)一步分型中，遇到困難，目前課題組正在努力處理，序列分析結(jié)果未能呈現(xiàn)。