楊小娜，張 琳，侯學(xué)霞，郝 琴

蜱是傳播多種人獸共患病病原體的重要媒介，寄主范圍廣泛，包括哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物。大多數(shù)蜱在幼蜱、若蜱、成蜱3個(gè)生長(zhǎng)階段中通過(guò)吸食宿主血液來(lái)維持生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。硬蜱攜帶的病原體?？梢鹑R姆病、斑點(diǎn)熱、無(wú)形體病、埃立克體病、森林腦炎、新疆出血熱、Q熱、新型布尼亞病毒感染等疾病發(fā)生[2]。由于蜱攜帶的病原體較多，一些新的蜱傳病原體不斷發(fā)現(xiàn)，蜱傳疾病在全球的分布范圍不斷擴(kuò)大，對(duì)家畜和人類(lèi)健康造成重大危害[3]。

蜱傳疏螺旋體根據(jù)引起人類(lèi)疾病的不同通常分為伯氏疏螺旋體和回歸熱螺旋體兩個(gè)分類(lèi)群。伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi，BB)是引起萊姆病的病原體，萊姆病在世界70多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道，是北美洲和歐亞大陸國(guó)家最常見(jiàn)的蜱傳疾病之一[4]。萊姆病可引起游走性紅斑、關(guān)節(jié)炎和其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[5]。目前，萊姆病螺旋體可分為20多個(gè)基因型，其中至少有5個(gè)能引起人類(lèi)疾病，包括B.burgdorferisensustricto(B.b.s.s)、B.garinii、B.afzelii、B.bavariensis和B.spielmani[6]。Borreliamiyamotoi(BM)于1994年在日本首次分離并被確認(rèn)為一種新的螺旋體。2011年，俄羅斯首次出現(xiàn)了人類(lèi)感染病例[7]，隨后在美國(guó)、歐洲、日本也發(fā)現(xiàn)了病例[8-10]。從系統(tǒng)進(jìn)化上講，它屬于回歸熱螺旋體，與大多數(shù)回歸熱螺旋體不同的是它不引起典型的回歸熱，并通過(guò)硬蜱傳播，可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，如腦膜腦炎[11]。

在亞洲，全溝硬蜱不僅是傳播B.burgdorferi的重要媒介，而且已被證實(shí)能夠傳播B.miyamotoi，白足鼠等嚙齒動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)等也是兩種螺旋體重要的宿主[5]。至今很多研究報(bào)道了B.burgdorferi與B.miyamotoi同時(shí)感染硬蜱的病原學(xué)證據(jù)，描述了二者在同一種群的流行狀況，也發(fā)現(xiàn)了二者混合感染的患者[12]。兩種病原具有相同的傳播媒介(硬蜱)和宿主動(dòng)物，同時(shí)人類(lèi)B.miyamotoi感染有一些與萊姆病難以區(qū)分的臨床表現(xiàn)，如皮膚紅斑、神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀等。在我國(guó)，尚未有報(bào)道利用熒光定量PCR方法用于檢測(cè)B.miyamotoi，因此，研發(fā)一種高效、快速和敏感的檢測(cè)方法用于檢測(cè)和區(qū)分這兩種病原體是非常必要的。在本研究中我們?cè)O(shè)計(jì)了一種能同時(shí)檢測(cè)這兩種病原體的雙重?zé)晒舛縋CR方法，具有良好的靈敏度和特異度，并用這種方法檢測(cè)了模擬樣本和新疆采集的200只硬蜱，對(duì)該方法進(jìn)行了初步的應(yīng)用評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料 對(duì)照菌株DNA：鉤端螺旋體、土拉弗朗西斯菌、巴爾通體、布魯氏菌、大腸埃希菌均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所相關(guān)科室提供。試劑與儀器：TaKaRa 熒光定量taq酶(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye, RR390)；Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；天根DNA提取試劑(DNeasy Blood&Tissue Kit)。

1.2 方 法

1.2.1 引物探針合成 分別根據(jù)B.burgdorferirecA基因、B.miyamotoi甘油磷酸二酯酶生物合成基因(glpQ)設(shè)計(jì)引物和探針[13-14]。兩組引物探針見(jiàn)表1，利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)確定其對(duì)目的基因的特異性。

表1 多重PCR引物和探針Tab.1 PCR primers and probes

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備B.burgdorferirecA基因擴(kuò)增片段為GTTCTGCAACATTAACACCTAAAGCTTTTGCATAAACAGGATCAAGAGCA-TGCTCAGCATCAATAAAAGCAGCTATCCCA-CCT(83 bp)，B.miyamotoiglpQ基因擴(kuò)增片段為ATGCACGACCCAGAAATTGACACAACCACA-AATGTTGCACAATTATTTCCCAATCGAGCT-AGAGAAAACGGACGATATTACGCCACTGA-CTT(78 bp)，擴(kuò)增片段交由上海生工公司合成質(zhì)粒。將4 μg質(zhì)粒干粉加入1 mL去離子水，得到質(zhì)粒濃度4 μg/mL(4 ng/μL)。每個(gè)堿基的平均分子量660，pUC57質(zhì)粒含2 710個(gè)堿基，單質(zhì)粒分子量為660×(基因片段堿基數(shù)+2 710)，每μL拷貝數(shù)=(質(zhì)粒濃度/單質(zhì)粒分子量)×10-9×阿伏伽德羅常數(shù)。計(jì)算得到兩種質(zhì)?？截悢?shù)均為1.3×109拷貝/μL。

1.2.3 單重?zé)晒舛縋CR

1.2.3.1 靈敏度 對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)的引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化后，確定最佳反應(yīng)體系。首先分別對(duì)recA、glpQ基因質(zhì)粒進(jìn)行單基因靶點(diǎn)的檢測(cè)，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度稀釋為109～10-1拷貝/μL，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，確保引物探針的可用性。

1.2.3.2 特異度 利用建立的單重?zé)晒舛縋CR體系，分別檢測(cè)鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。

1.2.4 雙重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)

1.2.4.2 靈敏度 利用109～10-1拷貝/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)中含recA基因上下游引物和探針(10 μmol/L)分別1 μL，glpQ基因上下游引物和探針(10 μmol/L)分別0.8 μL，去離子水0.6 μL，兩種陽(yáng)性質(zhì)粒各2 μL。每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，4個(gè)實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性結(jié)果則判定為陽(yáng)性，確定該方法的靈敏度。

1.2.4.3 與單重?zé)晒舛縋CR方法差異性比較 根據(jù)1.2.4.2靈敏度檢測(cè)結(jié)果，將雙重與單重實(shí)驗(yàn)的Ct值(熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))進(jìn)行比較，利用配對(duì)設(shè)計(jì)資料的Wilcoxon signed -rank test 符號(hào)秩和檢驗(yàn)，判斷單重與雙重檢測(cè)方法的結(jié)果有無(wú)明顯差別。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用1.2.4.2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)樣本濃度對(duì)數(shù)和Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.5 特異度 利用建立的雙重?zé)晒舛縋CR體系，檢測(cè)鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。

1.2.4.6 濃度變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 為探索使用雙重?zé)晒舛縋CR方法檢測(cè)病原體過(guò)程中，其中一種病原體在另一種病原體濃度變化背景下檢測(cè)結(jié)果的差異。設(shè)置第1組實(shí)驗(yàn)：recA質(zhì)粒濃度固定為104拷貝/μL，glpQ質(zhì)粒濃度106～102拷貝/μL；設(shè)置第2組實(shí)驗(yàn)：glpQ質(zhì)粒濃度固定為104拷貝/μL，recA質(zhì)粒濃度106～102拷貝/μL。如果在某一種病原體濃度變化時(shí)，另一種病原體的Ct值沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明在一種病原體濃度變化為背景時(shí)，對(duì)另外一種病原體的檢測(cè)沒(méi)有顯著影響。

1.2.4.7 探索其他病原體存在對(duì)檢測(cè)兩種病原體結(jié)果的影響 利用鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：

(1)只有recA和glpQ兩種陽(yáng)性質(zhì)粒。

(2)recA和glpQ兩種陽(yáng)性質(zhì)粒加上述5種病原體DNA，作為實(shí)驗(yàn)組探索其他病原體存在對(duì)兩種病原體檢測(cè)的影響。

(3)只有上述5種病原體DNA，不含有recA和glpQ兩種陽(yáng)性質(zhì)粒。

(4)不含有任何病原體DNA，用去離子水補(bǔ)齊體系。

1.2.5 樣品檢測(cè)

1.2.5.1 模擬樣本檢測(cè) 將梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)模板(107～103拷貝/μL)分別取1 μL加入9 μL檢測(cè)陰性(巢式PCR和熒光定量PCR反應(yīng)均為陰性)的蜱DNA中，此時(shí)濃度變?yōu)?06～102拷貝/μL，分別進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)。通過(guò)批內(nèi)及批間變異系數(shù)(CV)評(píng)價(jià)反應(yīng)的重現(xiàn)性。批內(nèi)重現(xiàn)性：同一批次內(nèi)，106～102拷貝/μL的模擬樣本分別設(shè)置3個(gè)平行樣本，分析各個(gè)稀釋度反應(yīng)Ct值的變異系數(shù)。批間重現(xiàn)性：以不同批次間(不同時(shí)間進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn))標(biāo)準(zhǔn)模板各個(gè)稀釋度反應(yīng)Ct值的變異系數(shù)評(píng)價(jià)批間重現(xiàn)性。

1.2.5.2 實(shí)際樣本檢測(cè) 利用本研究設(shè)計(jì)的雙重?zé)晒舛縋CR方法檢測(cè)采集于新疆200只蜱蟲(chóng)B.burgdorferi和B.miyamotoi的攜帶情況。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。

2 結(jié) 果

2.1 單重?zé)晒舛縋CR

2.1.1 靈敏度 用優(yōu)化好的反應(yīng)體系做單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)，取recA基因上下游引物探針濃度為500 nmol/L,glpQ基因上下游引物探針濃度為400 nmol/L。兩種基因能檢測(cè)到的最低濃度均為101拷貝/μL，一個(gè)反應(yīng)最少能檢測(cè)20個(gè)基因拷貝。

2.1.2 特異度 利用單重?zé)晒舛縋CR體系，檢測(cè)鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明特異性良好。

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR

2.2.1 靈敏度 雙重?zé)晒舛縋CR方法對(duì)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品有很好的檢測(cè)效果，重復(fù)樣本的Ct值變化很小，重復(fù)性較好(圖1)。recA和glpQ兩種陽(yáng)性質(zhì)粒能檢測(cè)到的最低濃度均為102拷貝/μL，一個(gè)反應(yīng)最少能檢測(cè)200個(gè)基因拷貝，與單重?zé)晒舛縋CR方法相比靈敏度下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

AB A：B. burgdorferi recA基因擴(kuò)增曲線；B： B. miyamotoi glpQ基因擴(kuò)增曲線圖1 雙重?zé)晒舛縋CR靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.1 Sensitivity experiments of duplex real-time PCR

2.2.2 與單重?zé)晒舛縋CR方法差異性比較 利用雙重和單重方法的Ct平均值，進(jìn)行配對(duì)設(shè)計(jì)資料的Wilcoxon signed -rank test符號(hào)秩和檢驗(yàn)。經(jīng)檢驗(yàn)，50.05，可認(rèn)為兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)差別(表2)。

表2 不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量值和期望值的比較Tab.2 Comparison of measured values and expected values

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線B.burgdorferirecA基因和B.miyamotoiglpQ基因的濃度對(duì)數(shù)分別與檢測(cè)Ct值呈線性相關(guān)，R2分別為0.993 7、0.996 2，接近于1，擬合效果好(圖2)。

ABA：B. burgdorferi recA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線； B：B. miyamotoi glpQ基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2 雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Duplex real-time PCR standard curve

2.2.4 特異度 利用雙重?zé)晒舛縋CR體系，檢測(cè)鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明特異性良好。

2.2.5 濃度變化影響 第1組實(shí)驗(yàn)：glpQ質(zhì)粒濃度變化時(shí)(106～102拷貝/μL)，recA質(zhì)粒(104拷貝/μL)檢測(cè)Ct值無(wú)明顯差別；第2組實(shí)驗(yàn)：recA質(zhì)粒濃度變化時(shí)(106～102拷貝/μL)，glpQ質(zhì)粒(104拷貝/μL)檢測(cè)Ct值無(wú)明顯差別(圖3)。說(shuō)明對(duì)于這兩種疏螺旋體，其中一種病原基因濃度變化對(duì)另一種病原體檢測(cè)的結(jié)果無(wú)明顯影響。

AB圖3 一種病原濃度變化對(duì)另一種病原體檢測(cè)結(jié)果(Ct值)的影響Fig.3 Effect of concentration on detection results (Ct values)

2.2.6 其他病原體存在對(duì)檢測(cè)B.burgdorferi和B.miyamotoi結(jié)果的影響 陰性對(duì)照(3)、(4)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，(1)、(2)BB和BM檢測(cè)均為陽(yáng)性，Ct值差別不大，但是(2)的最大熒光強(qiáng)度比(1)低(圖4)。說(shuō)明其他多種病原體DNA的存在會(huì)降低測(cè)量的熒光強(qiáng)度，但對(duì)于病原體的檢出沒(méi)有影響。

ABA：B. burgdorferi recA基因擴(kuò)增曲線；B：B. miyamotoi glpQ基因擴(kuò)增曲線圖4 其它病原體干擾實(shí)驗(yàn)的基因擴(kuò)增曲線Fig.4 Gene amplification curves when other pathogens interfere with the experiment

2.3 樣本檢測(cè)

2.3.1 模擬樣本檢測(cè) 通過(guò)對(duì)各濃度梯度(106～102拷貝/μL)模擬蜱樣本進(jìn)行檢測(cè)，均產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。同一批次內(nèi)模擬蜱樣本各濃度Ct值的變異系數(shù)為0.111～0.406(BB)、0.675～1.301(BM)，各批次間(不同時(shí)間進(jìn)行的3次試驗(yàn))各濃度Ct值的變異系數(shù)為0.412～1.238(BB)、0.285～1.149(BM)，說(shuō)明反應(yīng)具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性(圖5)。

圖5 模擬蜱樣本批內(nèi)和批間變異系數(shù)Fig.5 Intra-assay and inter-assay coefficient of variation of simulated tick samples

2.3.2 實(shí)際樣本檢測(cè) 在新疆地區(qū)采集到的200只蜱中，B.burgdorferi的recA基因檢測(cè)有11個(gè)陽(yáng)性(Ct值<37)，B.miyamotoi的glpQ基因檢測(cè)均為陰性。

3 討 論

B.miyamotoi與B.burgdorferi具有相同的傳播媒介和感染宿主，其感染具有相似的臨床癥狀和體征，能導(dǎo)致人類(lèi)嚴(yán)重疾病。我國(guó)已在黑龍江省牡丹江地區(qū)和山西省祁縣地區(qū)發(fā)現(xiàn)了蜱感染B.miyamotoi的病原學(xué)依據(jù)，其它地區(qū)尚未有相關(guān)報(bào)道[12,15]。在我國(guó)，尚無(wú)鑒定B.miyamotoi的熒光定量PCR方法的建立。為了能同時(shí)檢測(cè)和鑒別兩種疏螺旋體，提高鑒定效率，本研究利用B.burgdorferi的recA基因和B.miyamotoi的glpQ基因，建立了一種雙重?zé)晒舛縋CR方法。

本研究首先利用兩種病原陽(yáng)性質(zhì)粒分別進(jìn)行了單重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)，確保每對(duì)引物和探針都能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的病原體，同時(shí)確定反應(yīng)進(jìn)行的最佳引物和探針濃度。為了增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的可靠性，在單重實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立雙重?zé)晒舛縋CR方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明兩種病原體的引物探針沒(méi)有交叉反應(yīng)，對(duì)于不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)具有良好的區(qū)分度。雙重檢測(cè)實(shí)驗(yàn)靈敏度和特異度良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示Ct值與兩種病原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性相關(guān)關(guān)系。通過(guò)配對(duì)設(shè)計(jì)資料的Wilcoxon signed -rank test 符號(hào)秩和檢驗(yàn)判定單重和雙重方法測(cè)得的Ct值結(jié)果無(wú)明顯差異。病原體濃度變化和其他病原體DNA的存在對(duì)檢測(cè)Ct值沒(méi)有明顯的影響。我們利用建立的新方法檢測(cè)模擬蜱樣本和實(shí)際蜱樣本，證明了雙重?zé)晒舛縋CR方法的可行性和實(shí)用性。

在多重檢測(cè)體系中，多對(duì)引物和探針及熒光基團(tuán)之間會(huì)相互干擾，引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果靈敏度低、特異性不強(qiáng)的情況，我們使用了兩種方法來(lái)避免該問(wèn)題。一是設(shè)計(jì)探針時(shí)使每種病原體探針的報(bào)告基團(tuán)熒光發(fā)射最大波長(zhǎng)處于不同的光譜范圍，本實(shí)驗(yàn)選用的6-FAM(465-510)、VIC(533-580)兩種熒光染料，其波長(zhǎng)處于不同光譜范圍。二是在建立雙重?zé)晒舛縋CR方法前先做了顏色補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)，以確保熒光定量PCR儀的檢測(cè)通道能區(qū)分每種病原體的探針，顏色補(bǔ)償結(jié)果用于后續(xù)結(jié)果分析。

本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法能快速檢測(cè)蜱樣本中B.burgdorferi和B.miyamotoi，但是能否用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)或者人類(lèi)疾病的診斷分析還需要進(jìn)一步的研究。該方法快速、靈敏、特異，為我們提供了一個(gè)有價(jià)值的檢測(cè)工具，可用于病媒檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為疾病控制及生物安全提供了技術(shù)支持，也為臨床檢測(cè)提供了思路。