馬宗民，李淑嫻

(大連大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，大連 116622)

1 引 言

骨質(zhì)疏松癥可致頜骨骨質(zhì)丟失，引起頜骨骨質(zhì)疏松[1]。頜骨骨質(zhì)疏松可引起牙齒松動、脫落；影響種植體愈合；破壞咀嚼系統(tǒng)的功能協(xié)調(diào)，增加顳下頜關(guān)節(jié)疾病發(fā)生的機(jī)率；甚至引起消化系統(tǒng)功能障礙等疾病，嚴(yán)重影響人們的身心健康和生活質(zhì)量[2-4]。因此，頜骨骨質(zhì)疏松的防治引起很多學(xué)者的關(guān)注。有學(xué)者進(jìn)行了藥物防治的研究[1，4]，但藥物治療副作用大，且價(jià)格昂貴。

骨組織具有力學(xué)適應(yīng)性，生物力學(xué)因素是保持骨量的關(guān)鍵因素[5]。生物力學(xué)療法具有非藥物性、非侵入性、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。頜骨承載的載荷主要來自咀嚼運(yùn)動產(chǎn)生的咀嚼力。咀嚼運(yùn)動是人類的正常生理活動。因此，采用咀嚼力主動增強(qiáng)防治頜骨骨丟失易于實(shí)現(xiàn)，且成本低。

咀嚼運(yùn)動對頜骨的生長發(fā)育、外觀、微觀結(jié)構(gòu)等有重要影響。Mavropoulos等[6]研究了咀嚼對成年大鼠牙槽骨微觀結(jié)構(gòu)的影響。Alexander等[7]研究了咀嚼載荷對小鼠下頜骨的影響，認(rèn)為食物影響下頜骨形狀的微觀進(jìn)化。Hassan等[8]進(jìn)行了多代軟性飲食對小鼠顱面形態(tài)的影響。Campos等[9]研究了不同咀嚼方式牙槽骨的橫向尺寸的影響。Watson等[10]認(rèn)為咀嚼功能和松質(zhì)骨形態(tài)之間存在緊密的聯(lián)系。Bozzini等[11]認(rèn)為咀嚼負(fù)荷減小會降低生長期大鼠下頜骨的力學(xué)性能。

當(dāng)前研究多集中在正常硬度飼料或軟性飼料喂養(yǎng)對頜骨的影響，喂食高硬度飼料增強(qiáng)咀嚼功能對骨質(zhì)疏松頜骨影響的研究尚不多見。因此，本研究擬采用高硬度飼料喂食去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠，觀測牙槽骨微觀結(jié)構(gòu)及TGF-β、OPG、RANKL等表達(dá)的變化，探索主動增強(qiáng)咀嚼功能對頜骨骨丟失的保護(hù)作用及機(jī)制。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雌性SD大鼠，牙列完好，3月齡，體重250～300 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2008—0002。兩種硬度飼料，正常硬度(硬度123 N)飼料和高硬度(硬度216 N)飼料，均定制于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，營養(yǎng)成分一致，符合GB14924.3-2010的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合國家科技部、衛(wèi)生部《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》相關(guān)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。

2.2 試劑與儀器

ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；TIANScript RT KIT試劑盒(北京天根公司)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(北京天根公司)；離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；低溫冰箱(日本SANYO公司)；顯微CT機(jī)(德國Siemens公司)；酶標(biāo)分析儀(RT-6100，深圳雷杜公司)；微量加樣器(法國Gilson公司)；生物分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)；熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療)等。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1分組與處理 30只大鼠，正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開始試驗(yàn)，20只采取背部入路方式摘除卵巢，10只切除等量小塊脂肪，但不摘除卵巢(假手術(shù)組)，術(shù)后全部正常飼料喂食。2個(gè)月后，摘除卵巢大鼠隨機(jī)分為模型組和實(shí)驗(yàn)組。假手術(shù)組和模型組大鼠繼續(xù)正常硬度飼料(硬度123 N)喂食，實(shí)驗(yàn)組大鼠喂食高硬度飼料(硬度216 N)，分組喂食2個(gè)月后處死。

2.3.2取材 大鼠斷食、不斷水12～24 h后處死。

血清樣本：大鼠腹腔注射水合氯醛，腹主動脈取血，室溫靜止30 min以上，3 000轉(zhuǎn)/min、15 min離心取上清，分裝后于-80℃保存，備用。

頜骨樣本：取兩側(cè)上頜骨，去除軟組織，一側(cè)上頜骨置入10%福爾馬林溶液固定，另一側(cè)上頜骨放入-80℃冰箱保存， 備用。

2.3.3血清生化指標(biāo)檢測 血清雌二醇(E2)、骨鈣素(BGP)和堿性磷酸酶(ALP)采用ELISA試劑盒檢測。

2.3.4顯微CT檢測 利用顯微CT對大鼠上頜骨進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)為：電壓 80 kV、電流450 μA、分辨率15.48 μm，檢測第二磨牙區(qū)牙槽骨骨體積分?jǐn)?shù)( BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)等骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。

2.3.5TGF-β、OPG和RANKL基因表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法對上頜骨第二磨牙區(qū)牙槽骨中的TGF-β、OPG、RANKL的mRNA進(jìn)行表達(dá)測定。首先取骨組織樣品，利用Trizol 試劑提取組織中總RNA；應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；采用TIANScript RT KIT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；應(yīng)用SuperReal PreMix Plus試劑盒進(jìn)行定量擴(kuò)增；實(shí)時(shí)檢測循環(huán)閾值(Ct，cycle threshold)；模型組作為對照，采用比較CT法進(jìn)行相對定量分析。引物信息見表1。

表1 引物序列

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用獨(dú)立變量t檢驗(yàn)。設(shè)定P<0.05為差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清生化指標(biāo)

圖1和表2為大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果。由此可知，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清雌激素E2較假手術(shù)組顯著下降(P<0.05)，表明去勢手術(shù)成功；模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清骨鈣素BGP和堿性磷酸酶ALP較假手術(shù)組顯著上升(P<0.05)。與模型組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清雌激素E2上升，骨鈣素BGP和堿性磷酸酶ALP下降，但不顯著。

表2 大鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果

注：*與假手術(shù)組比較，*P<0.05。

3.2 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)

圖2和表3是大鼠上頜骨第二磨牙區(qū)牙槽骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果。與假手術(shù)組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組的骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度和骨小梁數(shù)量下降，骨小梁分離度升高，差異有顯著性(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，骨體積分?jǐn)?shù)升高，差異顯著(P<0.05)，骨小梁寬度升高、骨小梁數(shù)量升高、骨小梁分離度降低但不顯著。骨的微觀結(jié)構(gòu)有改善趨勢。

表3 大鼠上頜骨顯微CT檢測結(jié)果

3.3 TGF-β、OPG和RANKL基因

圖3和表4是大鼠上頜骨第二磨牙區(qū)牙槽骨TGF-β、OPG和RANKL基因表達(dá)檢測結(jié)果。與假手術(shù)組相比，模型組TGF-β、OPG下降，RANKL升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組TGF-β、OPG升高，RANKL下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 大鼠上頜骨TGF-β/OPG/RANKL基因檢測結(jié)果

注：*P<0.05(與假手術(shù)組比較)，#P<0.05(與模型組比較)。

注：*P<0.05(與假手術(shù)組比較)，#P<0.05(與模型組比較)

4 討論

頜骨骨質(zhì)丟失是全身骨質(zhì)丟失在口腔的局部表現(xiàn)，并導(dǎo)致的口腔嚴(yán)重問題[12]。雌激素水平下降可致頜骨骨質(zhì)丟失，摘除卵巢建立的骨質(zhì)疏松模型常用于頜骨骨質(zhì)丟失的研究[1，13]。本研究采用去勢的方法建立頜骨骨質(zhì)疏松動物模型。本研究發(fā)現(xiàn)去勢4 個(gè)月后，模型組與實(shí)驗(yàn)組及假手術(shù)組相比，雌激素E2水平顯著下降(P<0.05)，表明摘除卵巢手術(shù)成功；模型組微觀結(jié)構(gòu)退化，與假手術(shù)組存在顯著差異，發(fā)生骨質(zhì)疏松。

與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組雌激素E2有升高，但不顯著。有研究表明，適當(dāng)強(qiáng)度的運(yùn)動可以增加血清雌激素E2水平[14]。本研究結(jié)果趨勢與之基本一致，但結(jié)果差異并不顯著，分析原因可能是咀嚼運(yùn)動只是局部身體器官運(yùn)動所致。血清骨鈣素BGP、堿性磷酸酶ALP主要由成骨細(xì)胞分泌合成，是骨轉(zhuǎn)換和骨形成的特異性指標(biāo)[15-16]。從本研究結(jié)果看，模型組和實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組相比，骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)水平顯著升高，說明大鼠去勢后，骨重建處于活躍狀態(tài)，骨轉(zhuǎn)換率高；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)有降低，但不顯著，表明咀嚼力增強(qiáng)可在一定程度上抑制骨重建的活躍狀態(tài)和骨吸收，但未達(dá)到正常水平，這與文獻(xiàn)[16]、[17]基本一致。表明咀嚼力增強(qiáng)可能通過調(diào)節(jié)血清雌激素(E2)、骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)水平調(diào)控骨重建活躍度及平衡方向，改善骨質(zhì)疏松情況。

適宜的力學(xué)刺激能夠促進(jìn)骨生長。頜骨是重要的咀嚼器官，承載咀嚼負(fù)荷，頜是全身骨代謝最活躍的器官。本研究結(jié)果顯示，喂食高硬度飼料干預(yù)2個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，骨體積分?jǐn)?shù)顯著升高；骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量上升，骨小梁分離度降低，但不顯著。Mavropoulos等[18]認(rèn)為正常咀嚼功能的咀嚼力能夠延緩摘卵巢大鼠頜骨微觀結(jié)構(gòu)的退化。本研究是在摘除卵巢術(shù)后2個(gè)月喂食高硬度飼料進(jìn)行干預(yù)，保證術(shù)后形成骨質(zhì)疏松狀態(tài)，觀測咀嚼力增強(qiáng)對骨質(zhì)疏松干預(yù)效果。驗(yàn)證了增強(qiáng)咀嚼力基本能夠延緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。

TGF-β對骨重建有重要調(diào)節(jié)作用，在骨形成與骨吸收耦合平衡方面起著關(guān)鍵作用[19]。有研究顯示，力學(xué)刺激能夠促進(jìn)TGF-β在骨組織中的表達(dá)[20]。本研究實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨的TGF-β表達(dá)顯著高于模型組，這表明增強(qiáng)的咀嚼力能夠促進(jìn)牙槽骨中TGF-β的表達(dá)，與之前研究結(jié)論基本一致[20]。

OPG/RANKL/RANK信號通路是調(diào)節(jié)骨重建的重要信號通路[21]。OPG與RANKL的比值對體內(nèi)破骨細(xì)胞的形成和成熟起著決定作用，平衡傾向于OPG時(shí)，活性破骨細(xì)胞減少，平衡傾向于RANKL時(shí)，活性破骨細(xì)胞增加，從而影響骨平衡的方向。有研究表明，摘除卵巢骨質(zhì)疏松后，大鼠OPG表達(dá)下降，RANKL表達(dá)上升[22]。本研究模型組與假手術(shù)組相比，OPG表達(dá)顯著下降，RANKL表達(dá)顯著上升。力學(xué)刺激對OPG/RANKL/RANK信號通路有調(diào)節(jié)作用[23]。本研究實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，OPG顯著升高，RANKL顯著降低，表明增強(qiáng)咀嚼載荷能夠調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號通路。

5 結(jié)論

本研究采用高硬度飼料喂食去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠，觀測牙槽骨微觀結(jié)構(gòu)及TGF-β、OPG、RANKL等表達(dá)的變化，探索主動增強(qiáng)咀嚼功能對頜骨骨丟失的保護(hù)作用及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)咀嚼力對骨質(zhì)疏松大鼠頜骨骨質(zhì)丟失有一定的保護(hù)作用，對骨重建信號通道TGF-β與OPG、RANKL有一定的調(diào)節(jié)作用；增強(qiáng)咀嚼力會在一定程度上影響血清雌激素(E2)、骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)等生化因子的表達(dá)。

口腔環(huán)境非常復(fù)雜，牙槽骨重建還受到牙周炎等牙周病的影響，骨內(nèi)有多種信號調(diào)節(jié)通道。因此，增強(qiáng)咀嚼力進(jìn)行頜骨骨質(zhì)丟失的保護(hù)如何達(dá)到最好效果還需進(jìn)一步研究。