王高敏， 吳 越， 王 霞， 陳夫山， 吉 喆

(青島科技大學(xué) 海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院， 山東 青島 266042)

芹菜是一種具有藥用價(jià)值的兩年生傘形科草本植物，廣泛種植于歐洲、亞洲、非洲等地，在我國(guó)也有著悠久的栽培歷史[1]。芹菜中含有豐富的黃酮類化合物，這些物質(zhì)既可以為芹菜提供防御機(jī)制，保護(hù)芹菜免受不同生物威脅和非生物威脅[2]，也可以充當(dāng)信號(hào)素分子、植物抗毒素、排毒劑等，還具有抗菌防御、防霜凍和抗干旱的功能[3]。目前，芹菜中的黃酮類化合物已經(jīng)被提取出來應(yīng)用于保健食品、醫(yī)療健康等領(lǐng)域，且被證明具有抗氧化[4]、保護(hù)肝臟[5]、抗糖尿病[6]等功能。其中，芹菜素是芹菜中最主要的黃酮類化合物，主要以黃色素的形式存在于植物體內(nèi)[7]，是黃酮類化合物中藥性和生物活性最強(qiáng)的化合物之一，有抗癌、抗氧化、抗炎[8-9]、抗過敏、抗抑郁、保肝、抗血栓形成和抗衰老的功效[10]。

索氏提取法、熱回流法和浸漬法是目前應(yīng)用最廣的提取方法，但是這些方法耗時(shí)長(zhǎng)、耗能大、所用溶劑量大，限制了其應(yīng)用與發(fā)展[11]；膜分離技術(shù)可以依據(jù)膜的選擇透過性以及目標(biāo)物分子量的差異在壓力推動(dòng)下將目標(biāo)物質(zhì)分離、純化和濃縮[12]，但是對(duì)于分子量相接近、結(jié)構(gòu)相似的目標(biāo)化合物的分離效果較差。近年來，大孔樹脂純化技術(shù)[13-14]、聚酰胺樹脂純化技術(shù)[15-17]、葡萄糖凝膠樹脂純化技術(shù)[18-19]、制備型高效液相色譜技術(shù)[20-24]可以將黃酮類化合物進(jìn)行準(zhǔn)確分離，獲得高純度單體化合物，但這些提取純化方法耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，為實(shí)現(xiàn)芹菜的低成本高值化利用，開發(fā)一種高得率、高純度的提取方法至關(guān)重要。

超臨界流體萃取(SFE)是一種從植物中提取和純化各種生物分子的有效技術(shù)，是傳統(tǒng)萃取技術(shù)(如溶劑萃取法、液相蒸餾法)的有效替代方法。超臨界流體是介于氣體和液體之間的流體，兼有氣體液體的雙重性質(zhì)：一方面，其溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的快速高效分離[25]；另一方面，又具有較高的溶解能力，可在較低溫度下分離難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差和相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)。CO2具有無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒、價(jià)廉、易獲取、溶解性好等又優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的超臨界流體之一。然而，CO2是非極性物質(zhì)，對(duì)極性和強(qiáng)極性物質(zhì)的溶解能力較差。因此，需要向SFE體系中加入極性?shī)A帶劑以提高溶質(zhì)的溶解度和選擇性，從而增加產(chǎn)品收率[26-28]。SFE利用CO2和夾帶劑形成的流動(dòng)相，在強(qiáng)度、壓力、溫度、固定相種類等多種因素的協(xié)同下，在結(jié)構(gòu)類似物、同分異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體混合物的分離純化中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[29-30]。由于乙醇的溶解性能較好，對(duì)植物細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)，通常采用乙醇為夾帶劑提高對(duì)黃酮類弱極性物質(zhì)的萃取能力。因此，本研究采用超臨界CO2流體和不同濃度的乙醇夾帶劑協(xié)同萃取芹菜中的芹菜素，并采用高效液相色譜法進(jìn)行定量表征，以確定最佳的芹菜素萃取工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(98.0%，HPLC級(jí))，購(gòu)自上海阿拉丁生物科技有限公司；芹菜(Petroselinumcrispum)，系青島平度市馬家溝芹菜基地生產(chǎn)；無(wú)水乙醇(95%)，景明化工股份有限公司；無(wú)水乙醇(99%)，景明化工股份有限公司；乙酸(99.7%)，友和貿(mào)易股份有限公司；甲醇(100%)，友和貿(mào)易股份有限公司。

超臨界萃取設(shè)備，中國(guó)臺(tái)灣金屬工業(yè)研究中心；高效液相色譜儀，日本Hitachi公司:Pump,L-2130,Autosampler,L-2200,UV Detector,L-2400)；超聲波清洗器，F(xiàn)RQ-1004SHT型，杭州法蘭特超聲波有限公司；冷凍離心機(jī)，H5-21Kr型,湖南湘儀公司；電子天平,FA214型,上海豪晟公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品20,50,100,200,400 μg，用50%乙醇溶解并定容至10 mL，得到終濃度為2，5，10，20，40 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 超臨界萃取條件優(yōu)化

取250 g馬家溝芹菜粉末(顆粒大小在0.125 mm左右)，置于萃取槽中，在30 MPa、40 ℃的條件下進(jìn)行萃取，每30 min從分離槽中取樣一次，分離槽溫度設(shè)定為50 ℃，壓力設(shè)定為4.5 MPa，持續(xù)萃取4 h。本研究主要探討夾帶劑對(duì)萃取結(jié)果的影響，已有學(xué)者提出，夾帶劑濃度的提高有利于非極性物質(zhì)的萃取[31]，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一組不添加夾帶劑的萃取試驗(yàn)(SFE CO2)，一組添加95%濃度乙醇夾帶劑的萃取試驗(yàn)(SFE CO2+95%EtOH)，一組添加99%濃度乙醇夾帶劑的萃取試驗(yàn)(SFE CO2+99%EtOH)。本實(shí)驗(yàn)采用萃取槽體積為1 L(10.5 cm×11.1 cm)的萃取設(shè)備，以50 g·min-1的CO2流速進(jìn)行萃取，為避免堵塞，在萃取過程中同時(shí)從萃取槽出口端泵入流速為3.2 mL·min-1的乙醇溶液。當(dāng)使用夾帶劑時(shí)，以3.2 mL·min-1流速泵入乙醇與CO2在萃取槽入口端前預(yù)先混合再加熱，然后進(jìn)入萃取槽。

1.2.3 高效液相色譜測(cè)定芹菜素的含量

采用1.2.2的方法對(duì)芹菜素進(jìn)行萃取，所得芹菜粗萃物以及芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品用HPLC分析目標(biāo)組分含量。分析方法：色譜柱：Kromasil 100-5-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相按表1梯度進(jìn)行洗脫，分析波長(zhǎng)設(shè)定為343 nm，柱溫40 ℃，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

表1 流動(dòng)相洗脫程序Table 1 Mobile phase gradident elution program

1.2.4 提取率計(jì)算公式

本研究中芹菜粉原料在試驗(yàn)前均經(jīng)過干燥預(yù)處理，故芹菜素提取率為高效液相色譜分析出芹菜素質(zhì)量占原料投料量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。提取產(chǎn)物提取率的計(jì)算按照如下公式(1)進(jìn)行。

(1)

式(1)中:F—提取率(質(zhì)量分?jǐn)?shù));

m—提取出產(chǎn)物的質(zhì)量，g；

m0—原料投料量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖保留時(shí)間為45 min。依照1.2.3節(jié)的分析條件進(jìn)行測(cè)定，不同濃度芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC色譜圖如圖1所示。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得回歸方程為Y=0.065 1X(R2=0.997 5)。

圖1 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度梯度芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of apigenin standards

2.2 添加不同濃度乙醇為夾帶劑的超臨界萃取結(jié)果

將添加不同濃度乙醇為夾帶劑進(jìn)行超臨界萃取得到的樣品按照1.2.3的方法分析，得到的各個(gè)時(shí)間段的色譜如圖2所示。從圖2可以看出，3者色譜圖的信號(hào)峰數(shù)量與峰形極其相似，說明在這3種條件下所得到的產(chǎn)物基本一致。然而，不同濃度乙醇得到的產(chǎn)物的紫外吸收信號(hào)強(qiáng)度有明顯差異，這說明不同條件下超臨界萃取得到的芹菜素產(chǎn)率不同。為了分析不同萃取條件下芹菜素的產(chǎn)率以及在整個(gè)萃取過程中芹菜素萃取效率的變化，本研究依據(jù)外標(biāo)法對(duì)萃取出的粗萃物中的芹菜素進(jìn)行定量，結(jié)果如表2所示。

圖2 添加不同夾帶劑濃度超臨界萃取芹菜素色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of apigenin at different time periods in the process of different ethanol concentration

表2 僅使用CO2超臨界萃取過程中芹菜素含量Table 2 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2

由表2可知，在僅使用CO2進(jìn)行萃取時(shí)，前90 min僅有少量的芹菜素被萃取出來，HPLC幾乎檢測(cè)不到信號(hào)，這是因?yàn)镃O2溶劑是非極性溶劑，僅使用CO2難以溶劑黃酮類等極性物質(zhì)。在120 min時(shí)開始有芹菜素的信號(hào)被檢出，且此時(shí)芹菜素的萃取效率最高。當(dāng)萃取時(shí)間超過120 min后，芹菜素的響應(yīng)值逐漸減弱，萃取得到的芹菜素質(zhì)量逐漸減少。經(jīng)定量分析，在僅使用CO2進(jìn)行超臨界萃取時(shí)，芹菜素的萃取率僅為0.000 6%。

使用CO2和99%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量見表3。添加95%乙醇為夾帶劑萃取得到的樣品，其紫外吸收信號(hào)明顯高于不添加乙醇的樣品，這說明添加乙醇會(huì)更有效地萃取出芹菜素。在萃取過程前30 min萃取效率最高，120 min時(shí)芹菜素幾乎完全被萃取出來。在使用95%濃度的乙醇為夾帶劑與CO2共同進(jìn)行超臨界萃取的過程中，芹菜素的萃取率升高至0.006%。

表3 使用CO2和95%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量Table 3 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2+95%EtOH

使用CO2和99%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量見表4。由表4可見，以99%濃度乙醇為夾帶劑所萃取出的芹菜素含量低于95%濃度的乙醇，推測(cè)造成該現(xiàn)象的原因可能是增加乙醇濃度使得原料的濕度增加造成原料結(jié)塊，不利于溶質(zhì)分子與溶劑分子間的傳質(zhì)，降低了萃取率。在整個(gè)萃取過程中，前30 min萃取效率最高，120 min時(shí)芹菜素幾乎完全被萃取出來。在使用99%濃度的乙醇為夾帶劑與CO2共同進(jìn)行超臨界萃取的過程中，芹菜素的萃取率降至0.005%。

表4 使用CO2和99%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量Table 4 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2+99%EtOH

2.3 萃取過程分析

超臨界流體萃取過程中芹菜素含量變化曲線見圖3。如圖3所示，在僅使用CO2而不加入其他夾帶劑萃取芹菜素時(shí)，萃取效果最差，且其在前90 min內(nèi)幾乎檢測(cè)不到明顯的芹菜素信號(hào)；在添加乙醇夾帶劑與CO2共同進(jìn)行超臨界萃取時(shí)，芹菜素的得率有明顯提高，這可能是因?yàn)榍鄄怂馗兹苡跇O性溶劑。在使用夾帶劑輔助提取的過程中，濃度為95%的乙醇的提取效率要高于濃度為99%的乙醇，這說明適當(dāng)濃度的乙醇可以降低限制超臨界流體萃取芹菜根中芹菜素的因素，但當(dāng)濃度過高時(shí)也會(huì)降低傳質(zhì)效率從而抑制芹菜素的萃取。

圖3 超臨界流體萃取過程中芹菜素的含量變化曲線Fig.3 Apigenin mass curve in supercritical fluid extraction

在整個(gè)萃取過程中，前120 min萃取效率較高，約90%的芹菜素在這個(gè)時(shí)間段被萃取出來，隨著萃取時(shí)間延長(zhǎng)至150 min，芹菜素已經(jīng)基本被萃取完全，該結(jié)果對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有非常重要的意義。

3 結(jié) 論

1)比較在未添加夾帶劑萃取、添加95%乙醇輔助萃取、添加99%乙醇輔助萃取這3種情況下使用超臨界設(shè)備萃取出的粗萃物，發(fā)現(xiàn)添加乙醇為夾帶劑時(shí)萃取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于僅使用CO2萃取的萃取率，這可能是由于芹菜素更易溶于極性溶劑。

2)在使用夾帶劑進(jìn)行萃取時(shí)，濃度為95%的乙醇的萃取率要高于濃度99%的乙醇，萃取率為0.006%，這說明適當(dāng)濃度的乙醇可以降低限制超臨界流體萃取芹菜根中芹菜素的因素，但乙醇濃度過高也會(huì)抑制芹菜素的萃取。

3)在整個(gè)萃取過程中，前120 min萃取效率最高，約有90%的芹菜素被萃取出來，這對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。當(dāng)萃取時(shí)間持續(xù)到150 min時(shí)，芹菜素基本萃取完全。