丁唯嘉 ，葉浚韜，佘志剛，鐘艾青，黎子洋，林隆生，熊亞紅，李春遠(yuǎn)

1. 生物基材料與能源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東廣州 510642

2. 中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275

海洋紅樹林真菌是新穎活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的重要資源［1-3］?？鄼懰{(lán)Myoporum bontioidesA. Gray 屬于半紅樹植物類群，是我國唯一的苦檻藍(lán)屬植物，在沿海地區(qū)資源豐富［4-5］，我們從該植物中分離篩選到多株具有抗菌活性的內(nèi)生真菌［6］。在對其中Fusariumsp. R5 固相大米培養(yǎng)基發(fā)酵代謝產(chǎn)物初步研究中，得到了4 個(gè)大環(huán)脂肽類化合物，其中2個(gè)新單體具有抗植物病原菌活性［7］。本文繼續(xù)深入研究來自該菌固相培養(yǎng)代謝產(chǎn)物，共分離鑒定了10個(gè)化合物，分別為ZSU-H85 A (1) , 7-乙?；?1,3,6-三羥基蒽醌(2) , 6-[ (7S, 8R) -8-丙氧基-1-基]-4-甲氧基吡喃-2-酮(3)，6-戊基-4-甲氧基吡喃-2- 酮(4)， xylapyrone C (5)， simplicilopyrone（6）， 2-羥甲基-3-丙基苯酚(7)，(-)-brassicadiol（8），麥角甾醇和過氧麥角甾醇?；衔?～8 均為首次從Fusarium屬分離到?；钚詼y試表明，化合物6 對植物病原真菌香蕉炭疽菌［Colletotrichum musae(Berk. and M. A. Curtis) Arx，］ 和番茄枯萎菌[Fusarium oxysporumSchlecht. f. sp. lycopersici(Sacc. ) W. C. Snyder et H. N. Hansen] 顯示強(qiáng)抗菌活性，化合物1對上述兩菌顯示弱抑菌活性；化合物6，7，8 對致病細(xì)菌O1，O2 血清型雞大腸桿菌（avian pathogenicEscherichia coli） 顯示中等抑菌活性。 化合物1～8的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structures of compounds 1-8

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Bruker Biospin AV 600 核磁共振波譜儀，LCQ Advance MAX 液質(zhì)聯(lián)用儀，Horiba SEPA～300 旋光儀。HF254 薄層分析硅膠，40-140 目柱層析硅膠（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）， Sephadex LH-20 凝膠（GE Healthcare）， 所用試劑均為分析純。

1.2 菌種

真菌Fusariumsp. R5 分離自苦檻藍(lán)的根部，通過PCR 擴(kuò)增真菌核糖體ITS 基因區(qū)段（GenBank：MG867564）并與NCBI 數(shù)據(jù)庫中編碼為FJ037750. 1菌株對比（相似度99%） 確定菌屬［7］，植物病原菌香蕉炭疽菌、番茄枯萎菌及大腸桿菌（O1，O2 血清型）分別引種自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院及材料與能源學(xué)院天然資源再生與利用研究室，保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然資源再生與利用研究室。

1.3 菌種發(fā)酵及分離

采用大米無菌培養(yǎng)基（1 L 三角瓶，每瓶含大米85 g，水100 mL，粗海鹽0. 2 g），室溫靜置發(fā)酵40 d，共65瓶。將發(fā)酵物用乙醇提取3次，減壓濃縮，得膏狀物27 g。經(jīng)常規(guī)天然代謝產(chǎn)物純化流程，依次經(jīng)硅膠、凝膠柱層析，薄層層析純化得出化合物1 (8 mg), 2 (5 mg), 3 (1 mg), 4 (6 mg), 5 (1 mg),6 (5 mg), 7 (7 mg), 8 (6 mg), 9 (120 mg), 10 (55 mg)。

1.4 抗菌活性測試

通過二倍稀釋法［7］檢測化合物1，2，4，6～8 體外對香蕉炭疽菌、番茄枯萎菌，O2，O78血清型雞大腸桿菌抗菌活性，28 ℃下培養(yǎng)48 h，用三唑酮和氧氟沙星分別作為抗真菌和抗細(xì)菌的陽性對照，記錄最小抑菌濃度（MIC） 值， 實(shí)驗(yàn)平行測定3次。

1.5 化合物的物理和波譜數(shù)據(jù)

化合物1：C16H12O6，黃色粉末狀，MS (ESI)m/z:299. 06 [M-H]-, [α]25D=-28. 2 (c0. 10, MeOH),1H NMR (600 MHz, CD3COCD3)δ:1. 48 (d, 6. 5 Hz, 3H),5. 27(q, 6. 5 Hz, 1H) , 6. 64 (d, 2. 0 Hz,1H), 7. 21 (d,2. 0 Hz, 1H), 7. 58(s, 1H), 8. 36 (s, 1H),13C NMR(CD3COCD3, 150 MHz)δ: 23. 3, 65. 6, 107. 7, 107. 8,109. 9, 112. 9, 125. 7, 127. 0, 134. 1, 135. 8, 139. 6,159. 8, 164. 4, 165. 4, 181. 9, 186. 4。

化合物2：C16H10O6，黃色粉末狀，MS (ESI)m/z:297. 04 [M-H]-,1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:2. 68 (s, 3H), 6. 62 (d, 2. 8 Hz, 1H), 7. 13 (d, 2. 8 Hz,1H), 7. 61 (s, 1H), 8. 45 (s, 1H), 12. 91 (s, 1H);13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:30. 3, 108. 1, 108. 3,109. 4, 115. 3, 124. 2, 127. 7, 130. 2, 135. 2, 137. 2,163. 2, 164. 7, 165. 0, 181. 5, 184. 9, 200. 5。

化合物3：C11H14O4，無色晶體，MS (ESI)m/z:211. 1 [M+H]+, [α]25D=-100. 2 (c0. 10, MeOH),1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 0. 83 (t, 7. 2 Hz, 3H),1. 26 (m, 2H), 1. 65 (m, 2H), 3. 19 (m, 1H), 3. 38 (d,2. 4 Hz, 1H), 3. 77 (s, 3H), 5. 49 (d, 2. 4 Hz, 1H), 6. 09(d, 2. 5 Hz, 1H);13C NMR (DMSO-d6,150 MHz)δ:14. 6,19. 3, 33. 9, 54. 8, 56. 9, 61. 6, 88. 2, 99. 8, 163. 9,167. 3, 171. 4。

化合物4：C11H16O3，無色晶體，MS (ESI)m/z:197. 1 [M+H]+,1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ:0. 93 (t,6. 6 Hz, 3H), 1. 35 (m, 2H), 1. 36 (m, 2H), 1. 68 (m,2H), 2. 47 (t, 7. 5 Hz, ), 3. 83 (s, 3H), 5. 45 (d, 2. 2 Hz,1H), 5. 81 (d, 2. 2 Hz, 1H);13C NMR (CDCl3,150 MHz)δ:14. 2, 22. 0, 25. 9, 30. 0, 32. 7, 57. 1, 87. 3, 100. 0,164. 3, 165. 1, 170. 9。

化合物5：C11H16O4，白色晶體，MS (ESI)m/z:269. 0 [M+Na]+,1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:1. 32(m, 2H), 1. 44 (m, 2H), 1. 57 (dt, 7. 8 Hz, 2H), 2. 46 (t,7. 8 Hz, 2H), 3. 39 (dd, 6. 4 Hz, 11. 5 Hz, 2H), 3. 80(s, 3H), 4. 38 (t, 5. 4 Hz, 1H), 5. 54 (d, 2. 4 Hz, 1H),6. 06 (d, 2. 4 Hz, 1H);13C NMR (150 MHz, DMSOd6)δ:25. 4, 26. 7, 32. 7, 33. 2, 56. 8, 61. 1, 87. 8, 99. 9,164. 2, 166. 1, 171. 6。

化合物6： C9H14O4，無色晶體，MS (ESI)m/z:211. 1 [M+H]+, [α]25D=+76. 2 (c0. 10, MeOH),1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1. 00 (d,6. 6 Hz, 3H), 2. 11 (m,1H),2. 53 (m, 1H), 3. 58 (dd, 11. 0, 6. 0 Hz, 1H), 3. 62 (dd,11. 0,5. 5 Hz,1H), 3. 75 (s,3H), 4. 39 (d,3. 6 Hz,2H),5. 19 (s,1H);13C NMR (CDCl3,150 MHz)δ:14. 2, 36. 9,39. 3, 55. 8, 65. 6, 68. 2, 91. 2, 167. 0, 175. 0。

化合物7： C10H14O2，無色油狀物，MS (ESI)m/z: 167. 1 [M+H]+,1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:0. 97(t, 7. 4 Hz, 3H), 1. 55 (m, 2H), 2. 58 (t, 7. 8 Hz, 2H),4. 91 (s, 2H), 6. 73 (d, 8. 4 Hz, 1H), 6. 76 (d, 8. 4 Hz,1H), 7. 11 (t, 8. 4 Hz, 1H);13C NMR (CDCl3,150 MHz)δ: 14. 2, 24. 9, 35. 3, 60. 1, 114. 5, 121. 7, 122. 7,128. 9, 140. 8, 156. 7。

化合物8： C15H22O3， 無色針狀晶體， MS(ESI)m/z: 251. 2 [M+H]+, [α]25D=-18. 6 (c0. 10,MeOH),1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:0. 97 (t, 7. 8 Hz,3H), 1. 19 (s, 3H), 1. 35 (s, 3H), 1. 57 (m, 7. 8 Hz, 2H),1. 68 (brs, OH, 1H), 2. 41 (brs, OH , 1H), 2. 62 (m,2H), 3. 08 (dd, 15. 6 Hz, 9. 6 Hz, 1H), 3. 17 (dd, 15. 6 Hz, 9. 2 Hz, 1H), 4. 63 (dd, 1H, 8. 8 Hz, 8. 8 Hz, 1H),4. 71 (s, 2H), 6. 67 (d, 7. 6 Hz, 1H), 7. 01 (d, 7. 6 Hz,1H);13C NMR (CDCl3, 150 MHz)δ:14. 0, 24. 0, 25. 2,26. 3, 30. 4, 34. 5, 57. 2, 71. 8, 89. 7, 120. 2, 121. 8,124. 2, 124. 7, 140. 8, 158. 6。

2 結(jié)果與討論

13C NMR 譜顯示化合物1 具有12 個(gè)雙鍵碳及2個(gè)典型的δ181. 9，186. 4 的羰基碳，推測可能是蒽醌類化合物。1H NMRδ1. 48（d，6. 5 Hz，3H）的甲基及次甲基5. 27（q，6. 5 Hz，1H）相互連接，結(jié)合化學(xué)位移及質(zhì)譜數(shù)據(jù)推測次甲基上連有羥基。根據(jù)δ6. 64～8. 36的4組芳香質(zhì)子的耦合常數(shù)推測蒽醌的2個(gè)苯環(huán)上分別為β，γ位取代和間位取代，參考MS表明另外3個(gè)取代基均為羥基。由此與文獻(xiàn)［8-9］數(shù)據(jù)對比，鑒定結(jié)構(gòu)為ZSU-H85 A。

化合物2的波譜數(shù)據(jù)與1十分相似，13C NMR數(shù)據(jù)僅在δ65. 6少了一個(gè)碳，δ200. 5多了一個(gè)碳。但MS 表明化合物2 相對分子質(zhì)量比化合物1 少2，表明前者是后者連接羥基的CH 氧化為羰基的產(chǎn)物。由此與文獻(xiàn)［10］ 波譜數(shù)據(jù)對比基本相同，鑒定結(jié)構(gòu)化合物2為7-乙?；?1，3，6-三羥基蒽醌。

13C NMR 譜顯示化合物3 有一個(gè)酯羰基碳（δ171. 4），兩個(gè)雙鍵(δ88. 2, 99. 8, 163. 9, 167. 3),1H NMRδ5. 49 (d, 2. 4 Hz, 1H), 6. 09 (d, 2. 4 Hz, 1H)表明這5個(gè)碳和氧形成了六元內(nèi)酯環(huán)，且雙鍵間位有取代，δ3. 77（s，3H）表明其中一個(gè)取代基是甲氧基，δ0. 83 (t, 7. 2 Hz, 3H), 1. 26 (m, 2H), 1. 65 (m,2H), 3. 19 (m, 1H), 3. 38 (d, 2. 4 Hz, 1H) 結(jié)合碳譜δ14. 6～61. 6 的碳表明另一個(gè)取代基是一條5 個(gè)碳的鏈，其中有兩個(gè)碳連接氧，根據(jù)質(zhì)譜和碳譜所反映的分子式，表明分子中除了內(nèi)酯環(huán)外還存在另外一個(gè)環(huán)，推測可能是三元環(huán)氧環(huán)。由此與文獻(xiàn)［11］相關(guān)數(shù)據(jù)對照基本相同，因此鑒定化合物3 為6-[ (7S, 8R)-8-丙氧基-1-基] -4-甲氧基吡喃-2-酮。

化合物4的NMR 譜與化合物3相似，表明具有相同的骨架。綜合對比化合物4和3的13C、1H NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)前者比后者少了兩個(gè)連氧的次甲基碳，多了兩個(gè)亞甲基碳，表明相關(guān)取代基轉(zhuǎn)變成了正戊基。由此與文獻(xiàn)［12］相關(guān)數(shù)據(jù)對比基本相同，鑒定化合物4為6-戊基-4-甲氧基吡喃-2-酮。

化合物5的NMR 譜與化合物4整體相似。對比化合物5和4的13C 、1H NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)前者比后者少了一個(gè)甲基碳，多了一個(gè)連羥基的亞甲基碳，表明6位取代的正戊基轉(zhuǎn)化成了羥戊基。由此與文獻(xiàn)［13］ 波譜數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物5為xylapyrone C。

化合物6的13C NMR譜圖與化合物5相比少了一個(gè)雙鍵，對比化學(xué)位移值推測六元內(nèi)酯環(huán)5，6位的雙鍵轉(zhuǎn)變成了單鍵，1H NMRδ3. 75 (s,3H) 顯示-OCH3仍在，由此推測剩余的一個(gè)取代基含有3個(gè)碳，1H NMRδ1. 00 (d,6. 6 Hz, 3H)表明甲基連接在CH上，綜合分析氫譜碳譜及質(zhì)譜反映的相對分子質(zhì)量表明還剩余一個(gè)-CH2OH 結(jié)構(gòu)單元。由此與文獻(xiàn)［14］波譜數(shù)據(jù)及比旋光度對照基本一致，鑒定化合物6為simplicilopyrone。

化合物7 的13C NMR 譜δ114. 5～156. 7 的6 個(gè)雙鍵 碳及1H NMR 譜δ6. 73 (d, 8. 4 Hz, 1H), 6. 76 (d,8. 4 Hz, 1H), 7. 11 (t, 8. 4 Hz, 1H) 表明分子中存在1,2,3-三取代苯環(huán), 由1H NMRδ0. 97 (t, 7. 4 Hz, 3H),1. 55 (m, 2H), 2. 58 (t, 7. 8 Hz, 2H) 推測有一個(gè)正丙基，δ4. 91 (s, 2H) 推測有一個(gè)羥甲基，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)合碳譜推測剩下的一個(gè)取代基是羥基。由此與文獻(xiàn)［15］ 波譜數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物7為2-羥甲基-3-丙基苯酚。

對比化合物8和7的核磁數(shù)據(jù)，表明化合物8仍存在苯環(huán)，1H NMRδ6. 67 (d, 7. 8 Hz, 1H), 7. 01 (d,7. 8 Hz, 1H) 表明苯環(huán)變?yōu)?，2，3，4-四取代。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)取代基仍保留有正丙基、羥甲基。根據(jù)質(zhì)譜和核磁推導(dǎo)出分子式顯示5個(gè)不飽和度，表明分子除了苯環(huán)外還有一個(gè)環(huán)。1H NMRδ1. 19 (s, 3H),1. 35 (s, 3H)是兩個(gè)連接在季碳上的甲基,1. 68 (brs,OH, 1H), 2. 41 (brs, 1H, OH)滴加重水消失表明是兩個(gè)羥基，推測兩個(gè)甲基所連的季碳上連接了一個(gè)羥基。由此剩余δ4. 63 (dd, 1H, 8. 8 Hz, 8. 8 Hz, 1H)的連氧CH及連苯環(huán)的CH2只能和氧及苯環(huán)的兩個(gè)鄰位碳組成五元呋喃環(huán)。在此基礎(chǔ)上與文獻(xiàn)［16］ 波譜及比旋光度數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物8 為(-)-brassicadiol。

用文獻(xiàn)［7］報(bào)道的二倍稀釋法測試所得足量化合物1,2,4,6～8 體外抗菌活性。其中對番茄枯萎菌、香蕉炭疽菌抗菌活性（陽性對照三唑酮對兩菌最小抑菌質(zhì)量濃度MIC 分別為100 和80 μg/mL）測試結(jié)果顯示化合物6對兩菌的MIC均為50 μg/mL，活性強(qiáng)于陽性對照，表明化合物6可作為抗上述植物病原真菌的先導(dǎo)化合物開展深入研究。此外，化合物1 對兩菌MIC 分別為400 和200 μg/mL，其余測試結(jié)果MIC 均大于400 μg/mL。上述化合物對國內(nèi)常見的O1、O2 血清型雞大腸桿菌的抗菌測試結(jié)果顯示（陽性對照氧氟沙星對兩種血清型MIC分別為1. 25 和2. 0 μg/mL），化合物6 對兩種血清型菌的MIC 均為50 μg/mL，化合物7 對O1、O2 血清型雞大腸桿菌MIC 分別為12. 5 和25 μg/mL，化合物8對兩種血清型菌MIC 均為25 μg/mL，其余測試化合物MIC 均大于200 μg/mL。盡管化合物6～8僅對O1、O2 血清型雞大腸桿菌顯示中等抑菌活性，但它們均結(jié)構(gòu)簡單，后續(xù)可以考慮作為先導(dǎo)化合物開展結(jié)構(gòu)修飾嘗試增加抗菌活性。