劉文斌，李艷兵，周焱濤

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)病率逐漸增加的慢性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解及滑膜炎性反應(yīng)等[1-4]。近年來發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎療效確切，能夠多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療作用[5-6]。因此，開發(fā)可用于治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥對(duì)改善患者生活質(zhì)量具有重要意義。絞股藍(lán)為絞股藍(lán)屬植物的全草，其含有多種無機(jī)元素等，研究報(bào)道絞股藍(lán)皂苷提取物對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎性疼痛發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[7]。絞股藍(lán)總苷顆?？赏ㄟ^清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)減輕大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的癥狀。絞股藍(lán)皂苷抑制白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)[8]。然而絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在包括關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的各種自身免疫性疾病中起著關(guān)鍵作用[9]。研究報(bào)道lncRNA PICSAR在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑液中的表達(dá)明顯升高，通過刺激miR-4701-5p促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而造成關(guān)節(jié)破壞[10]。說明lncRNA PICSAR可影響關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。然而lncRNA PICSAR對(duì)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響，及絞股藍(lán)提取物是否調(diào)控lncRNA PICSAR也尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制是否與lncRNA PICSAR有關(guān)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞購自美國sciencell公司；(2)試藥試劑：絞股藍(lán)提取物(純度>98%)購自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技有限公司； IL-1β購自上海烜雅生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)購自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自美國Invent公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；(3)儀器設(shè)備：Multiskan FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FACS caliber流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；VCX750超聲波細(xì)胞破碎儀購自美國Sonics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年10月—2021年4月于湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)軟骨細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基在37℃的孵育箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(NC)組；用10 ng/ml的IL-1β作用軟骨細(xì)胞(誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞模擬其損傷)作為IL-1β組，分別用濃度為5、10、20 μg/ml的絞股藍(lán)提取物和10 ng/ml的IL-1β處理軟骨細(xì)胞，記為絞股藍(lán)提取物低、中、高劑量組；(2)將PICSAR抑制表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞6 h后，用10 ng/ml的IL-1β處理24 h，記為IL-1β+si-lncRNA PICSAR組、IL-1β+si-con組，研究抑制lncRNA PICSAR對(duì)軟骨細(xì)胞損傷的影響；將PICSAR過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞后6 h后，用20 μg /ml的絞股藍(lán)提取物和10 ng/ml的IL-1β處理24 h，記為pcDNA-lncRNA PICSAR+高劑量組、pcDNA-con+高劑量組，研究絞股藍(lán)提取物和lncRNA PICSAR對(duì)軟骨細(xì)胞損傷的影響。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：各組處理軟骨細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h，將10 μl的CCK-8溶液添加到每孔中，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm處的吸光度值(A)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集各組處理軟骨細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入結(jié)合緩沖液(1×Binding Buffer)400 μl重懸，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和PI混勻，避光孵育10 min；以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cleave-caspase-3的表達(dá)：提取各組軟骨細(xì)胞的總蛋白，定量后通過凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，封閉后加入裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleave-caspase-3)多克隆抗體(1∶800)，4℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影，成像后用Quantity One分析蛋白條帶的灰度值，以Cleave-caspase-3/β-actin條帶的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)氧化應(yīng)激性指標(biāo)MDA水平和SOD、CAT活性：收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，超聲10 min使細(xì)胞裂解，2 000 r/min離心20 min取上清，各項(xiàng)指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)lncRNA PICSAR表達(dá)水平：提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；lncRNA PICSAR上游引物序列：5'-GCTGAACTGCCTGGACTTTC-3'，下游引物序列：5'-GTCTGAGGAAGAGGCACCTG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，下游引物序列：5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算各組lncRNA PICSAR表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細(xì)胞活力降低、凋亡率升高，Cleave-caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，絞股藍(lán)提取物低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞活力依次升高、凋亡率依次降低，Cleave-caspase-3表達(dá)水平依次降低(P均<0.05)，見圖1、表1 。

圖1 不同濃度絞股藍(lán)提取物對(duì)OA軟骨細(xì)胞Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表1 不同濃度絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡影響的比較

2.2 不同濃度絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激影響的比較 與NC組比較，IL-1β組軟骨細(xì)胞中MDA水平升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，絞股藍(lán)提取物低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞中MDA水平依次降低，SOD和CAT活性依次升高(P均<0.05)，見表2。

表2 不同濃度絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激影響的比較

2.3 不同濃度絞股藍(lán)提取物對(duì)lncRNA PICSAR表達(dá)比較 與NC組比較，IL-1β組軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PICSAR表達(dá)水平升高(1.00±0.10 vs. 2.68±0.17，P<0.05)；與IL-1β組比較，絞股藍(lán)提取物低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PICSAR表達(dá)水平依次降低(2.17±0.15、1.68±0.12、1.21±0.09),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=254.805，P=0.000)。

2.4 抑制lncRNA PICSAR對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響比較 與IL-1β+si-con組比較，IL-1β+si-lncRNA PICSAR組lncRNA PICSAR表達(dá)水平、Cleave-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA水平均降低，軟骨細(xì)胞活力及SOD、CAT活性均升高(P<0.01)，見圖2，表3。

表3 抑制lncRNA PICSAR對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

注：A.IL-1β+si-con組；B.IL-1β+si-lncRNA PICSAR組；Cleave-caspase-3.裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

2.5 lncRNA PICSAR過表達(dá)在絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激中的影響 與pcDNA-con+高劑量組比較，pcDNA-lncRNA PICSAR+高劑量組lncRNA PICSAR表達(dá)水平、Cleave-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA水平升高，軟骨細(xì)胞活力及SOD、CAT活性均降低(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 過表達(dá)lncRNA PICSAR在絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

注：A.pcDNA-con+高劑量組；B.pcDNA-lncRNA PICSAR+高劑量組；Cleave-caspase-3.裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退化為特征的骨關(guān)節(jié)疾病，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞，軟骨細(xì)胞凋亡可直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變甚至鈣化，影響關(guān)節(jié)功能[11-12]。研究表明氧化應(yīng)激參與了骨關(guān)節(jié)炎的病理過程，氧化應(yīng)激可促使軟骨細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致病理損傷[13-15]。本實(shí)驗(yàn)用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞模擬其損傷情況，結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，MDA水平升高，SOD和CAT活性降低；表明IL-1β誘導(dǎo)了軟骨細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。研究報(bào)道絞股藍(lán)皂苷對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用，并對(duì)損傷的成骨細(xì)胞有促進(jìn)增殖分化的作用[16-17]。絞股藍(lán)總苷通過提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化活性對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用[18]。絞股藍(lán)皂苷通過同時(shí)抑制神經(jīng)元氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)來預(yù)防過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[19]。以上研究表明，絞股藍(lán)的有效成分皂苷具有抗氧化作用。為研究絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷是否有影響，本實(shí)驗(yàn)用不同劑量絞股藍(lán)提取物處理IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，Cleave-caspase-3表達(dá)水平降低，MDA水平降低，SOD和CAT活性升高。Cleave-caspase-3是凋亡相關(guān)蛋白，其表達(dá)水平升高表明細(xì)胞凋亡增多，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明絞股藍(lán)提取物可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

研究表明，lncRNA參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷[20]。研究報(bào)道，lncRNA MALAT1通過調(diào)節(jié)miR-150-5p/AKT3軸促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解[21]。lncRNA NR024118過表達(dá)可抑制脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[22]。而lncRNA PICSAR對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的影響尚不清楚。本結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PICSAR表達(dá)水平升高，提示lncRNA PICSAR可能參與軟骨細(xì)胞損傷過程。進(jìn)一步抑制lncRNA PICSAR表達(dá)后，軟骨細(xì)胞活力升高，Cleave-caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，MDA水平降低，SOD和CAT活性升高；表明抑制lncRNA PICSAR表達(dá)可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。過表達(dá)lncRNA PICSAR能夠逆轉(zhuǎn)絞股藍(lán)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響。

綜上，絞股藍(lán)提取物通過下調(diào)lncRNA PICSAR抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉文斌: 設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過程，論文撰寫;李艷兵:提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;周焱濤:實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析