楊謙，張軍，馬玉泉，譚雪敏

肺癌是最危險的癌癥之一，其生存率低于其他類型的惡性腫瘤，5年總生存率僅為10%～20%[1]。據(jù)報道，2018年新增肺癌病例210萬，死亡180萬[2]。盡管在手術(shù)、放療、化療和特定靶向治療方面取得了進展，但由于診斷發(fā)現(xiàn)晚，導(dǎo)致其預(yù)后仍不理想，進而出現(xiàn)癌細胞的轉(zhuǎn)移[3-4]。大量的基因組研究將肺癌與抑癌、致癌基因的表達、染色體畸變、氧化應(yīng)激等因素相聯(lián)系，這些因素影響了包括細胞生長、分裂、增殖、存活、運動、侵襲和細胞內(nèi)追蹤等多種細胞功能[5]。京尼平苷是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，主要用于心血管、消化系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，有研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)具有許多生物學(xué)作用，包括抑制細胞分化、調(diào)節(jié)細胞周期、抑制凋亡和腫瘤發(fā)生，有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在一些癌癥中的表達下調(diào)，包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌[7]。SIRT1作為一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白去乙?；?，具有非常廣泛的底物，不僅與組蛋白H1、H3和H4相互作用和調(diào)節(jié)，而且還與非組蛋白底物，如核因子-κB(NF-κB)、腫瘤抑制因子p53、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(Fox)和DNA修復(fù)因子E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)蛋白質(zhì)類相互作用[8]。然而，SIRT1在肺癌發(fā)展中的確切作用尚不清楚。因此，本研究重點探討京尼平苷對肺癌H1975細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，為肺癌的臨床治療提供參考，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗細胞：肺癌H1975細胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司)；(2)藥物試劑：京尼平苷(上海萬疆生物技術(shù)有限公司，原料藥，純度≥98%)；多柔比星(武漢市東康源科技有限公司，原料藥，純度99%)； RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白裂解液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(上海優(yōu)寧維生物有限公司)；鼠抗人SIRT1、NF-κB、β-actin一抗(美國abcam公司)；鼠抗人二抗(美國Invitrogen公司)。(3) 儀器：Herocell 180型CO2細胞培養(yǎng)箱(上海潤度生物科技有限公司)，DG5033A型酶標(biāo)儀(南京華東電子信息科技股份有限公司)，353097型Transwell小室(北京冬璞泰和科技有限責(zé)任公司)，TA500型顯微鏡(德國徠卡公司)，LAS-4000型凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.2 實驗方法 2021年1—2月在邯鄲市中心醫(yī)院實驗室進行實驗。

1.2.1 細胞培養(yǎng)：肺癌H1975細胞復(fù)蘇后，將其置于含有10% FBS、青霉素(100 μg/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)液，并在細胞覆蓋率達到70%左右時使用胰蛋白酶消化、傳代。

1.2.2 細胞分組及處理：將培養(yǎng)后的肺癌H1975細胞分為陰性對照組及京尼平苷低、中、高劑量組和陽性對照組[9-10]。陰性對照組：將肺癌H1975細胞5×105個/ml在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)環(huán)境5%CO2、2%O2、93%N2，37℃)；京尼平苷低、中、高劑量組：將京尼平苷10、20、40 μmol/L添加至肺癌H1975細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，方法同陰性對照組；陽性對照組：將多柔比星10 μmol/L添加至肺癌H1975細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，方法同陰性對照組。各組設(shè)置6個平行樣，均培養(yǎng)72 h。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 CCK-8法檢測細胞存活率：上述各組肺癌H1975細胞胰蛋白酶消化2 min，制作成細胞懸液，離心棄上清，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，使細胞懸浮，接種到96孔板中，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液，再加入新的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液。每孔加入RPMI 1640培養(yǎng)液100 μl和 CCK-8試劑10 μl，持續(xù)培養(yǎng)3 h，使用酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞存活率，細胞存活率=實驗組OD值/空白組OD值×100%。只加培養(yǎng)液、CCK-8試劑設(shè)為空白組。

1.3.2 Transwell小室測定細胞侵襲能力：將上述各組細胞接種到涂有基質(zhì)膠的Transwell小室上層，10%的FBS作為趨化劑添加到下腔室中，在37℃下孵育24 h后，對濾膜進行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下對細胞進行觀察，隨機選擇5個視野進行細胞計數(shù)(紫色細胞數(shù)量)，重復(fù)3次取平均值。

1.3.3 劃痕實驗法檢測細胞遷移能力：將上述各組肺癌H1975細胞以5×105個/孔的密度接種在培養(yǎng)板上黏附過夜，細胞密度在95%左右時，進行 200 μl槍頭劃痕，并在培養(yǎng)24 h后觀察細胞遷移，在劃痕0 h和24 h后使用顯微鏡獲得刮擦的圖像，檢查劃痕間隙，計算細胞遷移率，細胞遷移率=(0 h間隙距離-24 h間隙距離)/0 h間隙距離×100%[11]。

1.3.4 蛋白免疫印跡法檢測SIRT1、NF-κB蛋白表達：用超聲波細胞破碎儀使細胞破碎，采用蛋白裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液離心，上清液即為總蛋白，經(jīng)凝膠電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，將膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h，然后用鼠抗人SIRT1(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗在4℃條件下孵育2 h，PBS緩沖液清洗3次，加入二抗孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光試劑并在凝膠成像系統(tǒng)上顯影SIRT1、NF-κB和β-actin的蛋白條帶，并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺癌H1975細胞存活率比較 與陰性對照組比較，京尼平苷各劑量組與陽性對照組細胞存活率顯著降低，且京尼平苷低劑量組>中劑量組>高劑量組(P<0.05)；京尼平苷高劑量組和陽性對照組細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 各組肺癌H1975細胞侵襲細胞數(shù)比較 與陰性對照組比較，京尼平苷各劑量組與陽性對照組侵襲細胞數(shù)顯著降低，且京尼平苷低劑量組>中劑量組>高劑量組(P<0.05)；京尼平苷高劑量組和陽性對照組侵襲細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1。

圖1 各組肺癌H1975細胞侵襲細胞數(shù)比較(結(jié)晶紫染色，×200，箭頭表示侵襲細胞)

2.3 各組肺癌H1975細胞遷移率比較 與陰性對照組比較，京尼平苷各劑量組與陽性對照組細胞遷移率顯著降低，且京尼平苷低劑量組>中劑量組>高劑量組(P<0.05)；京尼平苷高劑量組和陽性對照組細胞遷移率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖2。

圖2 各組肺癌H1975細胞遷移率比較

表1 各組肺癌H1975細胞存活率、侵襲細胞數(shù)、細胞遷移率比較

2.4 各組肺癌H1975細胞SIRT1、NF-κB蛋白表達水平比較 與陰性對照組比較，京尼平苷各劑量組及陽性對照組SIRT1蛋白表達水平顯著升高，NF-κB蛋白表達水平顯著降低，且京尼平苷各劑量組隨劑量增加SIRT1蛋白表達水平升高，NF-κB蛋白表達水平降低(P<0.05)；京尼平苷高劑量組和陽性對照組SIRT1、NF-κB蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖3。

注： A.陰性對照組；B.京尼平苷低劑量組；C.京尼平苷中劑量組；D.京尼平苷高劑量組；E.陽性對照組

表2 各組肺癌H1975細胞SIRT1、NF-κB蛋白表達水平比較

3 討 論

肺癌仍然是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因[12]。其中肺腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞肺癌占全部肺癌病例的75%[13]。在中國，肺癌目前在所有癌癥中的發(fā)病率為第一位，同時也是病死率最高的惡性腫瘤[14]。

近50年來，在多個國家肺癌的發(fā)病率均呈上升趨勢，同時城市發(fā)病率高于農(nóng)村，經(jīng)濟較發(fā)達地區(qū)發(fā)病率較高[15]。由于臨床常規(guī)藥物治療的局限性和毒副作用，限制了肺癌的治療，因此了解和評價其具體作用機制，尋找有效的、安全的肺癌治療方法是一個迫切的問題。京尼平苷為一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止瀉、抑制胃酸分泌、治療軟組織損傷等功效[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷對乳腺癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可降低其遷移水平[17]。本研究中選用的肺癌H1975細胞屬于肺腺癌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給予京尼平苷干預(yù)后，可明顯抑制其增殖、遷移和侵襲水平，且隨著京尼平苷干預(yù)劑量的增加，其抑制效果更明顯，具有劑量—效應(yīng)關(guān)系，表明京尼平苷對肺癌H1975細胞作用明顯，可能在肺癌的治療過程中起到一定的作用。

SIRT1是sirtuin家族的一員，在哺乳動物細胞應(yīng)激反應(yīng)和細胞命運決定中起著重要作用，它能使核心組蛋白N端尾部的賴氨酸殘基脫乙酰，導(dǎo)致DNA卷曲，隨后轉(zhuǎn)錄降低[18-19]。最近的研究還表明，SIRT1在包括肺癌在內(nèi)的多種癌細胞中低表達，并且SIRT1的表達可能通過與叉頭框蛋白O(FOXO)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、腫瘤抑制因子p21、腫瘤抑制因子p53、蛋白激酶B(AKT)和共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變基因(ATM)的相互作用而與化療和放療的耐受性相關(guān)[20]。NF-κB是SIRT1的下游底物之一，NF-κB通過抗凋亡信號保護細胞免于死亡[21]。已有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1和NF-κB的表達水平在多種腫瘤中均發(fā)生異常，其表達水平與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移水平密切相關(guān)[22-23]。在本研究中，探討了SIRT1通過SIRT1/NF-κB途徑調(diào)節(jié)肺癌H1975細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在陰性對照組中，SIRT1呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，而SIRT1低表達可促進NF-κB的表達，從而導(dǎo)致NF-κB在肺癌H1975細胞中為高表達狀態(tài)，當(dāng)給予京尼平苷干預(yù)后，SIRT1表達上調(diào)，NF-κB表達下降，同時結(jié)合肺癌H1975細胞存活率、侵襲力和遷移力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移水平均受到抑制，因此推測京尼平苷可能通過SIRT1使組蛋白去乙?；档蚇F-κB的表達，從而導(dǎo)致肺癌H1975細胞免受NF-κB的抗凋亡作用，抑制肺癌H1975細胞的增殖，同時降低了肺癌H1975細胞的侵襲力和遷移力，達到降低腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。

綜上所述，京尼平苷可有效抑制肺癌H1975細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其作用效果與劑量密切相關(guān)，京尼平苷的抗增殖和轉(zhuǎn)移作用可能與調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路有關(guān)，可能通過促進SIRT1蛋白的表達來抑制其下游蛋白NF-κB的表達，從而抑制肺癌H1975細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊謙：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；張軍：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；馬玉泉：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；譚雪敏：進行統(tǒng)計學(xué)分析，課題設(shè)計