任順成，萬(wàn) 毅，李林政，潘天義

（1 河南工業(yè)大學(xué) 河南省天然色素制備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450001 2 河南中大恒源生物科技股份有限公司 河南漯河462600）

糖尿病是一種多病因綜合作用導(dǎo)致的代謝性疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌不足和（或）作用障礙引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂。世界衛(wèi)生組織將糖尿病主要分為兩類：Ⅰ型糖尿病，主要原因是胰腺β-細(xì)胞遭到破壞，導(dǎo)致血漿胰島素水平低下；Ⅱ型糖尿病，是一種非感染性慢性代謝綜合征，其特點(diǎn)是胰島素分泌受損和靶組織對(duì)胰島素作用的抵抗而導(dǎo)致的高血糖[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅱ型糖尿病是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的糖尿病，占所有糖尿病患者的90%以上，被認(rèn)為是主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。預(yù)計(jì)2030年糖尿病將成為人類第七大致死因素，被公認(rèn)為 “無(wú)聲殺手”。預(yù)計(jì)到2035年，受影響的人數(shù)將增加到5.92 億[3]。世界衛(wèi)生組織最近公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界大約有15 億成年人超重和肥胖，這使他們具有患糖尿病的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。

在食物消化過(guò)程中，淀粉被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶共同作用水解成單糖，抑制這些酶的活性可顯著降低餐后血糖升高[5-6]。抑制淀粉水解和葡萄糖的吸收是預(yù)防Ⅱ型糖尿病的有效途徑。近些年來(lái)，膳食活性成分在預(yù)防慢性疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前有800 余種植物提取物可能對(duì)糖尿病的治療起積極的作用[7]。關(guān)于植物提取物作為淀粉消化酶抑制劑的研究成為熱點(diǎn)。梔子是我國(guó)治療糖尿病傳統(tǒng)藥物，是一種含有多種有效活性成分的藥食兩用資源，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)等多種藥理作用[8-10]。肖小華等[11-12]報(bào)道梔子黃含量為1.67 g/kg 時(shí)能顯著降低不同糖負(fù)荷的小鼠血糖，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)梔子提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用的有效部分可能是環(huán)烯醚萜和梔子黃色素類。Zhou 等[13]通過(guò)研究梔子對(duì)治療Ⅱ型糖尿病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)糞便組學(xué)從側(cè)面證實(shí)了梔子黃的降糖效果。李春英等[14]報(bào)道梔子黃抑制α-葡萄糖苷酶活性，然而，具體作用機(jī)制不詳。本研究探討梔子黃對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的影響及其作用動(dòng)力學(xué)，通過(guò)光譜特征分析兩種淀粉消化酶結(jié)構(gòu)變化，揭示梔子黃對(duì)餐后血糖升高的抑制作用機(jī)制，以期為糖尿病患者功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子黃（色價(jià)500），河南中大恒源生物科技有限公司；小麥淀粉（含水量12.89%），泰州市好食惠調(diào)味品有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg），美國(guó)Sigma 公司；α-葡萄糖苷酶（7 000 000 U/mL），上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（PNPG），麥克林生化科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600B 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FA1004 電子分析天平，上海上平儀器公司；Multiskan FC 96 孔酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司；G9800A 熒光分光光度計(jì)，安捷倫科技有限公司；MVS-1 旋渦混合器，北京金北德工貿(mào)有限公司；SHZ-82 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梔子黃對(duì)α-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)研究 使用米氏方程（Michaelis-Menton）和Lineweaver-Burk 方程確定梔子黃對(duì)α-淀粉酶的抑制方式[15]。以小麥淀粉溶液作底物磷酸鹽緩沖液溶解后在80 ℃的水浴鍋中糊化30 min。淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%。梔子黃溶液質(zhì)量濃度定為0.5，0.7 mg/mL。向具塞試管中先加入不同濃度梔子黃溶液250 μL，再添加250 μL α-淀粉酶溶解液37 ℃振蕩10 min，再加入500 μL 不同濃度的底物溶液，每隔5 min 取出相對(duì)應(yīng)的試管并加入2.0 mL DNS 顯色劑沸水中加熱5 min 后冷卻至室溫，定容至25 mL，540 nm 處測(cè)量其吸光度。

1.3.2 梔子黃對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)研究α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶的試驗(yàn)方法大致相同。梔子黃溶液濃度仍然為0.5，0.7 mg/mL，試驗(yàn)中需要將作為底物的PNPG 溶液的濃度范圍設(shè)定為0.5～5.0 mmol/L。向96 孔酶標(biāo)板中先加入80 μL 磷酸鹽緩沖溶液按設(shè)定加入20 μL 不同濃度的梔子黃溶液和60 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃氣浴振蕩10 min 后加入20 μL PNPG 底物溶液，每隔5 min 取出酶標(biāo)板并加入100 μL 的0.2 mol/L 的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，用96 孔酶標(biāo)儀在405 nm 處測(cè)定吸光度。具體的方程計(jì)算情況與上述的α-淀粉酶的過(guò)程相一致。

1.3.3 α-淀粉酶熒光光譜測(cè)定 探究不同濃度梔子黃對(duì)α-淀粉酶的熒光猝滅光譜。在磷酸鹽緩沖液中配置質(zhì)量濃度0.025，0.1，0.3，0.5，0.7，1 mg/mL 的梔子黃；將α-淀粉酶（300 U/mL）溶解到pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液中，在3 mL 的α-淀粉酶的溶液中加入0.2 mL 不同濃度的梔子黃漩渦振蕩2 min 定容至10 mL。將混合液分別在30 ℃和37 ℃的水浴條件下恒溫振蕩30 min。以等量的梔子黃溶液為空白參比，激發(fā)波長(zhǎng)278 nm，發(fā)射波長(zhǎng)290 nm，狹縫寬度5 nm，在290～500 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行熒光發(fā)射光譜掃描。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析 α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析與α-淀粉酶類似，其中α-葡萄糖苷酶的酶活力大小為180 U/mL 激發(fā)波長(zhǎng)278 nm，發(fā)射波長(zhǎng)290 nm，狹縫寬度5 nm，在290～450 nm 波長(zhǎng)范圍下進(jìn)行熒光發(fā)射光譜掃描。其中的對(duì)照試驗(yàn)與上述α-淀粉酶的方法與操作相同。

同步熒光光譜試驗(yàn)與1.3.3 節(jié)過(guò)程大致相同，在上述熒光猝滅試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將參數(shù)改變?yōu)椋害?淀粉酶，α-葡萄糖苷酶均在波長(zhǎng)200～400 nm 范圍內(nèi)，通過(guò)設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)間隔和發(fā)射波長(zhǎng)間隔在△λ=15～60 nm 的設(shè)定下進(jìn)行熒光光譜掃描[16]。

酶的抑制動(dòng)力學(xué)可以通過(guò)以下方程表示：

Michaelis-Menton 方程：

Lineweaver-Burk 方程：

不同I下的雙倒數(shù)直線得出斜率Slope。利用I和Slope 再次作圖得出Kic。方程如下：

將斜率（Slope）或截距（Y-intercept）與I的二次重繪圖并進(jìn)行線性擬合。式（1）、（2）、（3）、（4）中：V——初始反應(yīng)速度，mg/mL/min；S——底物質(zhì)量濃度，mg/mL；Vmax——最大初始反應(yīng)速度，mg/mL/min；I——抑制劑質(zhì)量濃度，mg/mL；α——表觀系數(shù)；Km——米氏常數(shù)；Kic——競(jìng)爭(zhēng)性抑制常數(shù)；Kiu——非競(jìng)爭(zhēng)性抑制常數(shù)。

熒光猝滅通過(guò)Stern-Volmer 方程描述：

式（5）中：F0和F——分別為不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Ksv和Kq——分別為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)和受擴(kuò)散過(guò)程控制的雙分子熒光猝滅速率常數(shù)；[Q]——猝滅劑質(zhì)量濃度，mg/mL；τ0——熒光分子平均壽命（α-淀粉酶的τ0為2.97 ns，α-葡萄糖苷酶的τ0為10-8s）。

1.3.5 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算 結(jié)合常數(shù)結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)以下方程[17]描述：

式（6）中：Ka——梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)；n——結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.3.6 熱力學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià) 小分子與生物大分子之間可通過(guò)疏水鍵、靜電引力、范德華力和氫鍵等發(fā)生相互作用。熱力學(xué)參數(shù)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)可根據(jù)Van’t Hoff[15]方程確定：

式（7）中：R——大氣常數(shù)，其值為8.314 J/（mol·K）；T——反應(yīng)溫度（303 和310 K）；Ka——結(jié)合常數(shù)。自由能ΔG由下式計(jì)算：

ΔH和ΔS的值由lnKa對(duì)1/T的線性圖的斜率和截距計(jì)算。

1.3.7 梔子黃與淀粉消化酶相互作用的結(jié)合距離以水為參比，在300～500 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描梔子黃的紫外光譜，并根據(jù)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光光譜和梔子黃的紫外吸收光譜的重疊圖譜計(jì)算結(jié)合距離。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種距離依賴的相互作用，它是由供體分子（蛋白質(zhì)）向受體分子（藥物）非輻射傳遞的激發(fā)能。能量傳遞效率可以用來(lái)評(píng)價(jià)配體與蛋白質(zhì)中色氨酸殘基之間的距離[18]。

非輻射能量轉(zhuǎn)移將發(fā)生在供體（α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶）和受體梔子黃之間，而條件是（a）供體可產(chǎn)生熒光；（b）供體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有部分重疊；（c）供體和受體之間的距離約小于8 nm。根據(jù)F?rster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[19]，能量轉(zhuǎn)移效率（E）不僅與受體和供體之間的距離（r）有關(guān)，而且與臨界能量轉(zhuǎn)移距離（R0）有關(guān)，即：

式（9）中：R0——轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離，nm；r——受體與供體之間的距離，nm。

式（10）中：K2——供體與受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的空間取向因子；N——介質(zhì)的折射率；φ——不存在受體的情況下供體熒光量子產(chǎn)率；J——供體熒光發(fā)射光譜和受體吸收光譜之間的重疊積分；其計(jì)算公式如下：

式（11）中：F（λ）——熒光供體在波長(zhǎng)λ 的熒光強(qiáng)度；ε（λ）——受體在波長(zhǎng)λ 下的摩爾吸光系數(shù)。能量轉(zhuǎn)移效率E計(jì)算公式為：

式中：F0和F與方程式（5）中的相同。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 使用origin2017 作圖，使用SPSS 21 統(tǒng)計(jì)軟件包分析所有數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）。P<0.05 被認(rèn)為是顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制動(dòng)力學(xué)研究

本研究用淀粉和pNPG 作為底物得到α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的Lineweaver-Burk 圖，并確定其抑制類型，結(jié)果見(jiàn)圖1 和表1。對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶來(lái)說(shuō)最大速度（Vmax）值為0.52 和3.11×10-2mg/（mL·min）保持不變，不同濃度的梔子黃存在均使米氏常數(shù)（Km）增加表明：梔子黃在兩種酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）分子上與酶-底物結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并形成復(fù)合物，繼而通過(guò)減少底物與酶的結(jié)合來(lái)降低酶促速率。即梔子黃與α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶的活性中心結(jié)合，從而產(chǎn)生對(duì)酶蛋白活性的影響。這與多酚類物質(zhì)抑制淀粉消化酶類似[20]。競(jìng)爭(zhēng)性抑制常數(shù)Kic是抑制劑-酶復(fù)合物的解離常數(shù)，因此，1/Kic代表抑制劑與酶的締合常數(shù)；Kic值較低意味著抑制劑與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合親和力較高[21]。梔子黃對(duì)α-淀粉酶的Kic（1.47）大于α-葡萄糖苷酶Kic（0.58），意味著梔子黃對(duì)α-葡萄糖苷酶的結(jié)合親和力更高。

圖1 梔子黃對(duì)α-淀粉酶（a）和α-葡萄糖苷酶（b）抑制作用的Lineweaver-Burk 曲線Fig.1 Lineweaver-Burk curve of inhibitory effect of gardenia yellow on α-amylase（a）and α-glucosidase（b）

表1 梔子黃對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Inhibitory kinetic parameters of gardenia yellow on α-amylase and α-glucosidase

2.2 熒光光譜分析

圖2、圖3 反映了不同濃度的梔子黃在不同溫度下對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶之間的熒光光譜圖。隨著梔子黃濃度的增大，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)不同程度的降低，即熒光猝滅現(xiàn)象。此外，圖2 和圖3 發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射峰所處的波長(zhǎng)發(fā)生紅移，說(shuō)明梔子黃與兩種淀粉消化酶發(fā)生相互作用。為了闡述作用機(jī)制，使用Stern-Volmer 方程分析熒光數(shù)據(jù)。

圖2 梔子黃對(duì)α-淀粉酶熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectrum of gardenia yellow to α-amylase

圖3 梔子黃對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜圖Fig.3 The fluorescence spectrum of gardenia yellow to α-glucosidase

圖4 的Stern-Volmer 圖可以看到梔子黃對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer 的曲線是向y軸彎曲的曲線。熒光測(cè)量提供了有關(guān)發(fā)色團(tuán)分子附近分子環(huán)境的信息。蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度的降低稱為蛋白質(zhì)熒光猝滅，這種猝滅可通過(guò)不同的機(jī)制，碰撞猝滅（動(dòng)態(tài)猝滅）是激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)與溶液中的其它分子（猝滅劑）接觸而失活時(shí)發(fā)生。靜態(tài)猝滅為熒光團(tuán)與猝滅劑形成非熒光配合物[22]。線性Stern-Volmer 曲線表明蛋白質(zhì)中有一類熒光團(tuán)以相同的方式與淬滅劑相互作用，并且只有一種淬滅機(jī)制（動(dòng)態(tài)或靜態(tài)）發(fā)生。然而，當(dāng)淬滅程度較大時(shí)，經(jīng)常觀察到方程的正偏差。在這種情況下，F(xiàn)0/F與[Q]描述了一條向上的曲線，向y軸凹陷。通常，向上彎曲表明有幾種機(jī)制負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)中熒光團(tuán)的猝滅效應(yīng)（既有動(dòng)態(tài)猝滅又有靜態(tài)猝滅），或者它表明存在“作用域”（作用范圍[22]），即表觀靜態(tài)猝滅[23]。描述這種情況的Stern-Volmer方程的修改形式如下[20]：

圖4 梔子黃對(duì)α-淀粉酶（a）和α-葡萄糖苷酶（b）熒光淬滅Stern-Volmer 圖的影響Fig.4 Influences of gardenia yellow on fluorescence quenching Stern-Volmer graphs of α-amylase（a）and α-glucosidase（b）

將此方程兩邊取自然對(duì)數(shù)，作ln（F0/F）與[Q]的圖，得到一條直線，該直線斜率即為表觀靜態(tài)常數(shù)KSV即：

生物高聚物在不同的猝滅劑最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)是2×1010mol-1s-1，表2 中梔子黃對(duì)α-淀粉酶的猝滅常數(shù)（1.40×1011mol-1s-1/1.26×1011mol-1s-1）和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅常數(shù)（2.92×1011mol-1s-1/5.10×1011mol-1s-1）遠(yuǎn)大于2×1010mol-1s-1，說(shuō)明了猝滅方式是靜態(tài)猝滅為主，此外，猝滅常數(shù)反映了猝滅劑與生物高聚物的親和性[16，24]，α-葡萄糖苷酶的猝滅常數(shù)大于α-淀粉酶，說(shuō)明梔子黃對(duì)α-葡萄糖苷酶有更好的親和力。也印證了2.1 節(jié)抑制動(dòng)力學(xué)上梔子黃對(duì)α-葡萄糖苷酶有著更好的抑制作用。

圖5 梔子黃對(duì)α-淀粉酶（a）和α-葡萄糖苷酶（b）熒光淬滅Stern-Volmer 圖修改圖的影響Fig.5 Influences of gardenia yellow on modified fluorescence quenching Stern-Volmer charts of α-amylase（a）and α-glucosidase（b）

表2 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-volmer 方程及參數(shù)Table 2 Stern-Volmer equation and parameters of α-amylase and α-glucosidase

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點(diǎn)數(shù)

梔子黃對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合點(diǎn)數(shù)n如表3所示，隨著溫度的變化，兩種淀粉消化酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點(diǎn)數(shù)都發(fā)生了一定的變化，側(cè)面反映了溫度是梔子黃對(duì)兩種酶作用的重要因素，隨著溫度的升高，α-淀粉酶的Ka值下降，表明了梔子黃對(duì)α-淀粉酶的作用隨著溫度的升高，其親和力下降。而α-葡萄糖苷酶隨著溫度的升高其與梔子黃的親和力逐漸上升（30～37 ℃之間）。n值略大于1 說(shuō)明了梔子黃對(duì)于兩種消化酶的作用可能有著超過(guò)一個(gè)或者一類的結(jié)合位點(diǎn)[16]。也從數(shù)據(jù)可以看出在37 ℃的條件下α-葡萄糖苷酶的Ka大于α-淀粉酶，表明α-葡萄糖苷酶與梔子黃的親和力在同等條件下大于α-淀粉酶，與之前抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果類似。

表3 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點(diǎn)數(shù)Table 3 Binding constants and binding points of α-amylase and α-glucosidase

2.4 熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算

熱力學(xué)分析為了確定在上述基礎(chǔ)上梔子黃與淀粉消化酶相互作用的主因。表4 計(jì)算了α-淀粉酶的ΔH和ΔS的值為分別-43.22，-34.01 kJ/mol；α-葡萄糖苷酶ΔH和ΔS分別為234.882，0.874 kJ/mol?？梢愿鶕?jù)表5 中ΔH、ΔS取值情況推導(dǎo)出配體和生物分子之間作用力類型[25]。結(jié)果表明，梔子黃與淀粉消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的ΔG均為負(fù)值，表明結(jié)合過(guò)程是自發(fā)發(fā)生的。如表5所示，范德華力是梔子黃-α-淀粉酶相互作用過(guò)程中的主要驅(qū)動(dòng)力。疏水作用力是梔子黃-α-葡萄糖苷酶相互作用過(guò)程中的主要驅(qū)動(dòng)力[26]。

表4 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算Table 4 Calculation of thermodynamic parameters of α-amylase and α-glucosidase

表5 熱力學(xué)參數(shù)分析Table 5 Thermodynamic parameter analysis

2.5 同步熒光測(cè)量

由圖可知，隨著梔子黃的加入α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的兩種氨基酸殘基發(fā)生熒光猝滅，當(dāng)Δλ=15 nm 時(shí)，α-淀粉酶的酪氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)從297 nm 藍(lán)移至284 nm。α-葡萄糖苷酶的酪氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)從292 nm 藍(lán)移至287 nm。藍(lán)移和紅移分別代表熒光載體（Tyr 和Trp）周圍疏水性和極性環(huán)境的增強(qiáng)[25]。可能由于梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用，引發(fā)酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致兩種淀粉消化酶酪氨酸殘基疏水性增加，所處微環(huán)境的極性有所減弱。當(dāng)Δλ=60 nm 時(shí)，可明顯看出α-淀粉酶的色氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)從287 nm 紅移至290 nm，而α-葡萄糖苷酶的色氨酸殘基變化不大，該結(jié)果闡明了α-淀粉酶因梔子黃的加入使色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性，也一定程度反映了隨著在梔子黃加入對(duì)α-淀粉酶酪氨酸殘基和色氨酸殘基附近都會(huì)產(chǎn)生構(gòu)象的變化，而梔子黃對(duì)α-葡萄糖苷酶的影響主要是在酪氨酸殘基附近。

圖6 α-淀粉酶同步熒光光譜圖Fig.6 Synchronous fluorescence of α-amylase

圖7 α-葡萄糖糖苷酶同步熒光光譜Fig.7 The synchronous fluorescence spectrum of α-glucosidase

2.6 梔子黃與淀粉消化酶結(jié)合距離計(jì)算

梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離見(jiàn)表6。從表6 可以看出梔子黃與α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離r分別為4.77 nm 和5.19 nm，均小于8 nm，且都滿足0.5R0＜r＜1.5R0的條件，表示梔子黃與兩種淀粉消化酶之間可以發(fā)生相互作用且極可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移[27-29]。

圖8 梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶重疊光譜圖Fig.8 Overlapping spectra of gardenia yellow with α-amylase and α-glucosidase

表6 梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離Table 6 Binding distance between gardenia yellow and α-amylase and α-glucosidase

3 結(jié)論

梔子黃通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式能顯著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性。相比于α-淀粉酶，梔子黃對(duì)α-葡萄糖苷酶的親和力可能更高。梔子黃通過(guò)自發(fā)的范德華力、疏水作用力分別對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶發(fā)生相互作用。梔子黃能夠引起兩種酶氨基酸殘基的構(gòu)象改變，主要作用兩種酶的酪氨酸殘基和色氨酸殘基。非輻射能量轉(zhuǎn)移在梔子黃與兩種消化酶之間發(fā)生概率很大，進(jìn)一步印證了梔子黃與兩種消化酶相互作用的可能性。該研究表明梔子黃可能對(duì)糖尿病患者癥狀改善具有積極的作用，這為篩選淀粉消化酶抑制劑及相關(guān)功能食品的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。