李佳樂，毛可敏，桑亞新，高 潔

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071000）

雪蓮菌（Tibet Kefir），又稱藏靈菇，是源于我國西藏的一種天然混菌發(fā)酵體系，由乳酸菌、酵母、醋酸菌等多種微生物附著在蛋白質(zhì)、多糖等基質(zhì)上形成肉眼可見的顆粒[1]，對牛乳等具有發(fā)酵作用。多菌相的共生發(fā)酵使得雪蓮菌發(fā)酵乳具有獨特醇香及起泡性[2]，被譽為“香檳酸奶”，深受大眾喜愛。不僅如此，國內(nèi)外多項研究表明，雪蓮菌顆粒及其發(fā)酵乳具有降脂[3]，抑制腫瘤[4]，調(diào)節(jié)胃腸道[5]，免疫調(diào)節(jié)[6]等多種有益功能，并具有良好的抑菌性能[7]，在傳統(tǒng)的家庭制作過程中，非無菌操作的情況下也能保持自身微生態(tài)的穩(wěn)定。雪蓮菌發(fā)酵乳作為牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，未形成規(guī)?；a(chǎn)故僅限于當(dāng)?shù)孛耖g流行。

雪蓮菌粒只在原粒的基礎(chǔ)上，以傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式增殖，不僅增殖速度緩慢，而且其微生態(tài)體系為動態(tài)平衡，使得發(fā)酵過程難以控制，發(fā)酵乳風(fēng)味和品質(zhì)不均一。目前通過純培養(yǎng)發(fā)酵劑模擬雪蓮菌發(fā)酵乳的嘗試，涉及的菌種組成簡單，所得產(chǎn)品無法達(dá)到原粒發(fā)酵乳所具有的風(fēng)味和功能特性。曲宜[8]、石海波[9]、劉克營[10]、Chen[11]、Ng[12]等學(xué)者致力于人工模擬雪蓮菌顆粒的研究，嘗試構(gòu)建菌相組成清晰，發(fā)酵過程可控的發(fā)酵劑，然而，尚未得到理想的結(jié)果。了解雪蓮菌粒的形成機制和生長特性，是實現(xiàn)雪蓮菌粒人工模擬的必要條件。本文結(jié)合國內(nèi)外的研究進(jìn)展，以雪蓮菌顆粒理化組成為出發(fā)點，根據(jù)目前已有的雪蓮菌顆粒形成機制的相關(guān)研究，凝練出生物膜假說、聚集假說、共生假說3 種顆粒形成機制的推論。

1 雪蓮菌粒理化組成規(guī)律

不同于天然形成的混菌發(fā)酵體系，人工重組雪蓮菌顆粒，能夠形成菌相組成明確，發(fā)酵條件可控，發(fā)酵乳品質(zhì)穩(wěn)定的發(fā)酵劑，是實現(xiàn)其規(guī)模化生產(chǎn)的必要條件，也是目前亟待打破的瓶頸。盡管不同培養(yǎng)環(huán)境雪蓮菌顆粒菌相組成差別較大[13]，但是通過對多項研究的綜合分析發(fā)現(xiàn)，其在物理結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及微生物組成分布等方面還是具有一定的規(guī)律性，為人工模擬雪蓮菌顆粒提供了切入點。

1.1 物理結(jié)構(gòu)

雪蓮菌粒呈乳白色，顆粒成團(tuán)，形狀不規(guī)則，大小不一，粒徑在5～20 mm（圖1）。雪蓮菌粒的生長在宏觀上主要體現(xiàn)為菌粒的體積增大、數(shù)量增多；而在微觀上是其微生物群體的生長和繁殖。為更進(jìn)一步了解雪蓮菌粒的結(jié)構(gòu)，學(xué)者們進(jìn)行了積極探索。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)kefir ?？梢源蜷_拉伸成為一層厚的膜狀物質(zhì)（圖2）。Lu 等[15]通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)雪蓮菌粒由呈中空球狀結(jié)構(gòu)的小顆粒單元組成（圖3）。這些研究表明，與花椰菜結(jié)構(gòu)類似，雪蓮菌粒是由無數(shù)個由膜狀物質(zhì)形成的中空顆粒單元組成。此外，從解剖的角度研究雪蓮菌粒（復(fù)雜的團(tuán)狀物質(zhì)），可為進(jìn)一步揭示雪蓮菌粒結(jié)構(gòu)提供參考。

圖1 雪蓮菌粒的宏觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Macroscopic structure of Tibet kefir grains

圖2 kefir 粒形態(tài)[14]Fig.2 Morphology of kefir grain[14]

圖3 雪蓮菌粒的立體顯微鏡圖像[15]Fig.3 Stereomicroscope images of Tibet kefir grain[15]

1.2 化學(xué)成分

雪蓮菌粒是一種由蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)組成的包含著復(fù)雜微生物菌系的特殊共生系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，除了80%的水分，kefir 粒含約4%～6%的蛋白質(zhì)，6%～9%的糖類以及1%～2%的脂肪等[1，16-17]。其中乳酸菌能夠分泌生成一類特殊的蛋白質(zhì)-表層蛋白（surface-layer protein，SLP）以及獨特的糖類物質(zhì)——胞外多糖開菲爾多糖（kefiran）。

在許多真細(xì)菌和古生菌的菌株表面都含有一層規(guī)則的蛋白質(zhì)晶體陣列（圖4），稱為SLP，分子質(zhì)量為40～200 ku，自組裝能力是其關(guān)鍵特性之一[18]。目前已證實多種乳酸桿菌含有SLP[19]，如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、高加索乳桿菌（Lactobacillus kefir）、類高加索乳桿菌（Lactobacillus parakefir）、卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）等，分子質(zhì)量在25～71 ku 之間，疏水性氨基酸和堿性氨基酸占主體，帶正電荷的氨基酸含量高于帶負(fù)電荷的氨基酸含量，使得乳酸桿菌SLP 的等電點較高（9.4～10.4）[20]。研究發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌ATCC 14869、卷曲乳桿菌JCM 5810、嗜酸乳桿菌ATCC 4356 等菌株存在多個SLP 編碼基因，且這一現(xiàn)象并不是乳酸菌獨有[19]。乳酸桿菌SLP 在基因序列上存在一定規(guī)律。Malamud 等[21]研究分離自kefir 粒的聚集性和非聚集性高加索乳桿菌表達(dá)的SLP 編碼基因，發(fā)現(xiàn)其基因序列在N-末端區(qū)域相對保守，菌株間的主要差異在C-末端區(qū)域。盡管分離自不同的kefir 粒，其中的聚合菌株的SLP 還是100%同源的。

圖4 透射電鏡下SLP 的冰凍蝕刻圖[18]Fig.4 Transmission electron micrograph of a freeze-etched preparation of SLP[18]

在kefir 粒中還有一種獨特的胞外多糖開菲爾多糖（kefiran），它是由葡萄糖（glucose）和半乳糖（galactose）通過糖苷鍵連接的水溶性雜多糖（圖5），由馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）、高加索粒乳桿菌（Lactobacillus kefirgranum）、類高加索乳桿菌、高加索乳桿菌及德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus）等乳酸桿菌產(chǎn)生[22]。黏度和彈性是kefiran 的兩個重要流變特性，kefiran 低質(zhì)量濃度（4 g/L）時具有牛頓流體特性，而在較高質(zhì)量濃度時表現(xiàn)為假塑性[22]。對于雪蓮菌粒復(fù)雜的組成目前還未明晰，而SLP 和多糖的結(jié)構(gòu)解析及特性分析可為揭示其形成機制提供重要參考。

圖5 kefiran 化學(xué)結(jié)構(gòu)推測[22]Fig.5 Proposed chemical structure of kefiran[22]

1.3 微生物組成及分布

不同的雪蓮菌粒微生物組成有所不同，地理來源和培養(yǎng)環(huán)境是影響組成菌相的主要因素[13]。此外，由不同的微生物菌相鑒定方法得出的菌相組成也會存在差別[23]。對2011-2020年間發(fā)表的26 篇關(guān)于雪蓮菌和kefir 粒菌相組成研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)盡管不同菌粒之間的菌相組成差異很大，優(yōu)勢菌相在屬水平上還是具有一致性，包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈球菌屬（Streptococcus）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、假絲酵母屬（Candida）、酵母屬（Saccharomyces）和醋酸菌屬（Acetobacter）（表1），它們之間的相互作用和共生關(guān)系使雪蓮菌粒穩(wěn)定生長。其中，出現(xiàn)頻率最高的菌株為馬乳酒樣乳桿菌、高加索乳桿菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）（圖6）。總結(jié)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和酵母菌的數(shù)量較多，醋酸菌數(shù)量最少，其中乳酸菌數(shù)量范圍在104～108CFU/mL，酵母菌數(shù)量范圍在105～108CFU/mL，醋酸菌菌數(shù)在105CFU/mL[16-17，24]。另外，高潔等[25]運用宏基因組學(xué)技術(shù)研究kefir 粒的細(xì)菌菌相組成，共鑒定到8 個屬，其中乳球菌屬、醋酸菌屬和乳桿菌屬分別占細(xì)菌總數(shù)的74%，10%和5%。

表1 不同kefir 樣品的菌相組成Table 1 Microbial composition of different kefir samples

圖6 2011—2020年雪蓮菌菌相組成研究詞云圖Fig.6 Word cloud picture of study on the Tibet kefir grain microbial composition from 2011 to 2020

除菌相組成外，菌粒中微生物分布位置也存在一定規(guī)律。Wang 等[14]的掃描電鏡結(jié)果顯示，雪蓮菌粒外表面的微生物密度大于內(nèi)部，大量的短棒狀乳酸菌附著在菌粒外表面，而內(nèi)表面分布的多為長鏈狀的乳酸菌（圖7）。Lu 等[15]研究也發(fā)現(xiàn)從外表面到內(nèi)表面酵母菌和細(xì)菌的菌體密度呈下降趨勢，并在組成菌粒的顆粒單元壁上觀察到由細(xì)菌組成的多面體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，酵母菌鑲嵌其中（圖8）。與其結(jié)果一致，Gao 等[45]研究4 個來源于不同地區(qū)的雪蓮菌粒，發(fā)現(xiàn)酵母菌主要分布在細(xì)菌群落表面或鑲嵌其中（圖9）。雖然天然發(fā)酵體系雪蓮菌粒的復(fù)雜組成尚未明確，但是已發(fā)現(xiàn)的雪蓮菌粒的理化組成規(guī)律為全面認(rèn)識雪蓮菌粒，探究其形成機制提供了重要線索。即雪蓮菌顆粒是以釀酒酵母、高加索乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、單孢釀酒酵母、乳酸乳球菌、馬克斯克魯維酵母等菌相組成為主的微生態(tài)體系，其中酵母菌鑲嵌聚集在桿狀菌中。

圖7 掃描電鏡觀察雪蓮菌粒的微觀結(jié)構(gòu)[14]Fig.7 Microstructure of Tibet kefir grain observed by scanning electron microscope[14]

圖8 西藏雪蓮菌粒中的微生物分布[15]Fig.8 Microbial distribution of Tibet kefir grain[15]

圖9 來自西藏及周邊地區(qū)的4 個雪蓮菌粒的掃描電子顯微鏡圖[45]Fig.9 Scanning electron microscope images of four Tibet kefir grains from Tibet and the surrounding areas[45]

（續(xù)表1）

2 雪蓮菌顆粒形成機制假說

2.1 生物膜假說

雪蓮菌粒作為一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其形成過程中涉及多種因素。要探究一個微生物復(fù)雜聚集體的形成，首先要明確微生物聚集的基礎(chǔ)是什么，其次是什么因素使得各種復(fù)雜微生物聚集成團(tuán)而不是自由分散。2012年，有學(xué)者基于菌株間的聚集作用研究提出這樣的假設(shè)，認(rèn)為在菌粒形成初始，馬乳酒樣乳桿菌和turicensis酵母相互聚集形成菌團(tuán)顆粒；隨著pH 值逐漸降低，由于菌株表面特性和聚集能力的影響，乳桿菌和酵母菌等逐漸吸附到菌團(tuán)顆粒上，形成薄層生物膜；接著，隨著培養(yǎng)時間的延長，浮游菌株繼續(xù)聚集，逐漸形成三維立體顆粒，直至kefir 粒的形成[14]。基于此，作者認(rèn)為微生物菌體的成膜特性、相互聚集能力以及微生物間的共生關(guān)系等可能和菌粒的形成息息相關(guān)。

生物膜是微生物菌體的集群現(xiàn)象，是與浮游微生物相對的概念，由菌體細(xì)胞及胞外聚合物（胞外多糖、蛋白質(zhì)等）附著在生物或非生物表面混合形成[51]。胞外基質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)、DNA 等是生物膜的重要組成。生物膜不是微生物簡單地聚集，而是連續(xù)、有組織的，具有三維空間結(jié)構(gòu)和信息傳遞系統(tǒng)，被自身分泌物包裹，復(fù)雜性極高的細(xì)菌群體，代表著一個高水平的生物系統(tǒng)，能夠幫助微生物抵抗環(huán)境中的不良因素，減少菌體的死亡，提升菌粒的穩(wěn)定性[52]。生物膜的形成是一個復(fù)雜的過程：首先形成一個用于附著的表面→細(xì)胞牢固黏附在此表面→浮游細(xì)胞通過胞間相互作用繼續(xù)黏附→形成生物膜結(jié)構(gòu)[53]。

Wang 等[14]提出的kefir 粒的成粒假說中生物膜是雪蓮菌粒產(chǎn)生的基礎(chǔ)。Han 等[54]從kefir 發(fā)酵乳形成的生物膜中分離篩選到馬克斯克魯維酵母、乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌、高加索乳桿菌、sunkii 乳桿菌和東方醋酸桿菌，研究其表面疏水性、zeta 電位、菌體聚集情況等，發(fā)現(xiàn)除東方醋酸桿菌外其余菌株都表現(xiàn)出一定的生物膜形成能力，其中，馬克斯克魯維酵母的生物膜形成能力最強。井雪萍[55]對來自青海和東北民間的雪蓮菌粒的研究表明，兩種來源的雪蓮菌粒均具有較強的生物膜形成能力，其生物膜上含有豐富的微生物，細(xì)菌主要有6 種，真菌2 種。與之對比，原粒中細(xì)菌主要有12 種，真菌7 種。Wang 等[14]從kefir 粒中分離出4 株乳酸菌：馬乳酒樣乳桿菌HL1，高加索乳桿菌HL2，腸膜明串珠菌HL3，乳酸乳球菌HL4；3 株酵母菌：馬克斯克魯維酵母HY1，turicensis 酵母（Saccharomyces turicensisHY2），發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentansHY3）。研究發(fā)現(xiàn)HL2、HY1、HY2、HY3 單獨培養(yǎng)以及HY1、HY3 分別和4 株乳酸菌共培養(yǎng)均能形成致密的生物膜。生物膜的研究現(xiàn)狀為雪蓮菌粒的形成機制研究打下基礎(chǔ)，然而，目前研究中菌體形成的生物膜生物量小，無法保證微生物的持續(xù)增長。這一問題的解決將成為菌粒形成研究的重大突破。

2.2 聚集假說

菌株的聚集能力是菌體形成生物膜的基礎(chǔ)，雪蓮菌粒中菌株之間的相互聚集與菌株的表面特性、胞外多糖及表面蛋白密切相關(guān)[56]。

2.2.1 微生物表面特性 菌株的表面特性（疏水性、表面電荷等）被認(rèn)為是菌株間聚集或與其它介質(zhì)結(jié)合的影響因素之一。有學(xué)者對雙歧桿菌的表面性質(zhì)及黏附性的研究表明，具備自聚力和菌體表面疏水性高的雙歧桿菌具有更高的黏附力[57]。湯華成[58]在研究來自water kefir 的半乳糖霉菌（Galactomyces geotrichum）表面特性發(fā)現(xiàn)，其具有很強的疏水性，表面呈堿性，表現(xiàn)出極強的自聚能力，同時與高加索乳桿菌之間表現(xiàn)出一定的共聚能力，只是隨著時間的推移共聚速率減緩。井雪萍[55]從kefir 粒生物膜上分離出6 種菌，其疏水性、zeta電位、自聚集、共聚集和生物膜成膜試驗表明，菌體疏水性越強，zeta 電位值越低，菌體自聚集越強，生物膜形成能力也越高。Wang[14]及Han[54]的研究中也發(fā)現(xiàn)雪蓮菌?；騥efir 粒中微生物菌株表面的疏水性與菌株的成膜能力、聚集能力呈正相關(guān)。此外，細(xì)胞表面存在的蛋白、多糖、菌毛、脂磷壁酸等物質(zhì)和細(xì)胞器也會影響菌體表面疏水性的強弱，進(jìn)而影響菌體間的聚集。

2.2.2 表層蛋白和胞外多糖 乳酸桿菌SLP 具有保護(hù)菌體，影響菌體表面性質(zhì)，參與菌體黏附腸道過程和抑制病原菌對腸道入侵等作用[59]。其中，SLP 的主要功能之一是參與介導(dǎo)菌體與不同表面的黏附，如菌株間的自聚集，不同菌株間的共聚集，對腸上皮細(xì)胞的黏附等。Alp 等[60]研究分離自奶酪、腌菜等發(fā)酵食品的乳酸菌（干酪乳桿菌、cibaria 魏斯氏菌（Weisella cibaria）、植物乳桿菌、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）），發(fā)現(xiàn)去除SLP 的菌體，其自聚集、共聚集、黏附性顯著降低，而菌活性未受到較大影響。Golowczyc 等[61]研究SLP 對高加索乳桿菌和解脂酵母（Saccharomyces lipolytica）間共聚作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化鋰處理去除SLP 后，二者間的共聚率明顯下降。Fina 等[62]從嗜酸乳桿菌ATCC 4356 細(xì)胞中提取純化SLP，研究其與原核生物細(xì)胞壁成分（如肽聚糖、脂磷壁酸）、真核生物細(xì)胞壁成分（如黏蛋白、甲殼素）以及與病毒、細(xì)菌、酵母菌和血細(xì)胞的相互作用。結(jié)果表明，SLP 的C-端部分具有凝集素樣活性，能與不同的糖表位發(fā)生相互作用。

雪蓮菌胞外多糖kefiran 具有極強的膠黏性。Piermaria 等[63]證實從kefir 粒中提取的多糖kefiran 具有成膜特性，且這種多糖形成的薄膜厚度隨多糖溶液濃度的增加而增大（圖10）。此外，發(fā)酵食品中酵母菌細(xì)胞表面的甘露聚糖在菌體共聚方面發(fā)揮著重要作用。Hirayama 等[64]對比研究甘露聚糖基因缺失的酵母菌突變株，發(fā)現(xiàn)福山壺醋中植物乳桿菌ML11-11 細(xì)胞SLP 與釀酒酵母細(xì)胞表面甘露聚糖相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞共聚集，對混合生物膜的形成有重要作用。作者認(rèn)為SLP 對菌體黏附的介導(dǎo)作用，胞外多糖的膠黏性及識別作用對微生物菌體間的聚集發(fā)揮著重要作用，可進(jìn)一步運用分子技術(shù)從基因?qū)用嫜芯垦┥従韺拥鞍缀桶舛嗵?，揭示SLP 和kefiran 多糖的作用機制。

圖10 kefiran 多糖形成的薄膜切片[63]Fig.10 Cross-section micrographs of kefiran films[63]

2.3 共生假說

作為天然的混菌發(fā)酵體系，雪蓮菌上多種微生物的共生關(guān)系是維持菌粒形成及穩(wěn)定生長的基礎(chǔ)。乳酸菌與酵母菌的雙重發(fā)酵是雪蓮菌發(fā)酵乳的重要特征，也是通過兩種菌相共生而實現(xiàn)的。雪蓮菌粒內(nèi)的微生物相互關(guān)系可以總結(jié)為細(xì)菌與酵母菌間相互作用、細(xì)菌與細(xì)菌間相互作用以及酵母菌與酵母菌間相互作用3 類[13]，其中細(xì)菌與酵母菌間的相互作用是最主要的，也是大多數(shù)發(fā)酵食品的核心部分。酵母菌（非乳糖消耗型）不僅可利用乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸作為碳源，提高環(huán)境中pH 值，促進(jìn)乳酸菌生長，而且酵母菌可以消耗環(huán)境中氧氣，為乳酸菌提供更適宜生長環(huán)境。此外，酵母菌能夠供給細(xì)菌豐富的維生素、生長因子和必需的氨基酸。

Mendes 等[65]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究kefir 粒的釀酒酵母與德氏乳桿菌保加利亞亞種的相互作用，確定以下相互作用機制：德氏乳桿菌保加利亞亞種分解消耗乳糖產(chǎn)生半乳糖，為釀酒酵母提供碳源，而釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳，促進(jìn)德氏乳桿菌保加利亞亞種的生長。Cheirslip 等[66]研究發(fā)現(xiàn)來自kefir 粒的釀酒酵母和馬乳酒樣乳桿菌的相互作用增加了馬乳酒樣乳桿菌的多糖產(chǎn)量。這種微生物間強大的共生關(guān)系可能是雪蓮菌顆粒形成的重要前提。曾有學(xué)者嘗試?yán)萌斯ぽd體復(fù)配雪蓮菌粒發(fā)酵劑，雖然模擬出的西藏靈菇粒與原粒相似，發(fā)酵乳特性相近，但是在傳代培養(yǎng)過程中載體質(zhì)量有所損失，增殖率為負(fù)[8]。共生形成顆粒的假說解釋現(xiàn)有人工模擬雪蓮菌顆粒失敗的原因之一，可能是未建立起二者之間的共生關(guān)系。

3 結(jié)語

雪蓮菌粒作為天然發(fā)酵體系，在自然環(huán)境下形成和增殖，其中多種不可控因素賦予其復(fù)雜的理化組成及菌粒形成機制，涉及菌株的表面性質(zhì)、聚集黏附能力、共生關(guān)系等多個方面?，F(xiàn)有的人工模擬菌粒研究并未全部滿足這些成粒假說的條件。在接下來的研究中，可考慮用多個因素的共同作用來闡明雪蓮菌粒的形成機制，構(gòu)建理化組成明確、發(fā)酵性能穩(wěn)定的人工模擬菌粒。