張勝男，楊制國，袁立敏，胡小龍

(1. 內蒙古自治區(qū)林業(yè)科學研究院，內蒙古 呼和浩特 010010； 2. 內蒙古自治區(qū)沙地(沙漠)生態(tài)系統(tǒng)與生態(tài)工程重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010010)

菌根是菌根真菌菌絲與高等植物營養(yǎng)根系形成的聯(lián)合共生體。據(jù)統(tǒng)計，全世界約97% 的陸生維管植物都能形成菌根結構。有研究表明，菌根真菌能夠增強植物對水分和養(yǎng)分的吸收、促進光合作用、提高植物的抗旱能力[1-3]、改善和增加植株的生物量[4]。Smits等[5]研究認為，樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)幼苗接種外生菌根真菌，能夠顯著提高根際土壤有效磷的含量并促進植株生長。Zhang等[6]研究表明，油松(Pinustabuliformis)幼苗接種外生菌根真菌Handkeautriformis、Suilluslactifluus和Suillustomentosus能夠顯著提高幼苗根干重及根系活力。溫祝桂等[7]研究表明，將外生菌根真菌接種至黑松(Pinusthunbergii)根部，顯著提高了針葉葉綠素a、葉綠素b的含量，增加了黑松體內脯氨酸含量，同時顯著降低幼苗根Na+/K+比值，從而促進了幼苗的生長。因此，菌根真菌在植物生長和土壤肥力改善中具有非常重要的作用。

沙地云杉(Piceamongolica)是內蒙古渾善達克沙地特有鄉(xiāng)土樹種之一，天然林集中分布在克什克騰旗的白音敖包自然保護區(qū)。森林火災、病蟲害使沙地云杉林的面積不斷縮減，種群恢復工作刻不容緩。目前，關于沙地云杉菌根的相關研究大多集中于系統(tǒng)分類方面[8-9]，而對菌根促進生長等方面研究較少。基于以上原因，開展了分離鑒定沙地云杉菌根真菌的工作，并分析其促生作用，該研究對沙地云杉育苗以及種群恢復具有重要意義。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于內蒙古自治區(qū)克什克騰旗的白音敖包自然保護區(qū)內，地理坐標為43°31′03′′—43°31′29′′N，117°11′02′′—117°11′28′′E，平均海拔 1 338.43 m，屬溫帶草原氣候，年平均氣溫 -1.4 ℃，無霜期131 d，年降水量360～440 mm，集中于6—8月，年平均蒸發(fā)量1 036 mm。土壤為沙質灰色森林土。沙地云杉天然林長勢良好，林下主要野生植物有蒙古黃芪(Astragalusmongholicus)、防風(Saposhnikoviadivaricata)、山刺玫(Rosadavurica)、扁蓿豆(Medicagoruthenica)和披堿草(Elymusdahuricus)等。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

沙地云杉根段樣品于2017年7月采集。選擇5～10 a生的沙地云杉幼苗20株，選擇一側挖出沙地云杉根部，取直徑1～5 mm的根段若干，放入無菌自封袋中，置于4 ℃車載冰箱保存，盡快帶回實驗室進行菌種分離。沙地云杉種子采自白音敖包自然保護區(qū)沙地云杉天然林。盆栽育苗土壤為沙地云杉天然林土壤和蛭石以體積比1∶1混合。

2.2 試驗方法

2.2.1菌根真菌分離

將采集的沙地云杉根段進行鏡檢，對具有菌絲團的根段在流動自來水下沖洗干凈。將根段轉移至無菌操作臺中，用 75% 乙醇浸泡5 min，無菌水沖洗數(shù)次，再用 2% 次氯酸鈉溶液浸泡12 min，充分消毒后用無菌水沖洗數(shù)次。消毒后的根段置于無菌操作臺中自然風干，根段兩端用滅菌的剪刀剪斷棄除，根段中間部分置于PDA培養(yǎng)基上，兩端緊貼培養(yǎng)基表面，每個培養(yǎng)皿中放置4段根段。吸取500 μL最后一次消毒的無菌水洗滌液涂布于PDA培養(yǎng)基上檢測是否徹底消毒。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，待菌落長出后采用菌絲尖端切割分離法進行菌落純化，直至獲得純菌。

2.2.2菌根真菌鑒定

采用分子生物學手段對沙地云杉菌根真菌進行鑒定。在培養(yǎng)過程中觀察菌落的大小、質地、顏色、邊緣等形態(tài)特征。同時，在培養(yǎng)皿上刮取足量的活化后菌絲，加液氮研磨成粉末后采用CTAB法提取真菌基因組DNA。以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物擴增其ITS序列。PCR反應體系為20 μL：2.0 μL 10 × Ex Taq buffer，1.6 μL 2.5 mM dNTP Mix，0.8 μL ITS1，0.8 μL ITS4，0.5 μL模版DNA，0.2 μL 5u Ex Taq和 14.1 μL ddH2O。PCR反應參數(shù)為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。獲得的PCR產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工公司測序，測序結果經過校對后通過GenBank的Blast進行在線同源性比對，明確沙地云杉菌根真菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

2.2.3促生作用分析

將分離獲得的純菌分別接種于硅酸鹽和難溶性磷酸三鈣固體PKO培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10 d，觀察是否有菌落長出。

將收集的沙地云杉天然林土壤除去植物根，與蛭石按體積比1∶1混合均勻，分別裝入紙杯中，121 ℃高溫高壓滅菌20 min，晾涼后在杯中放入6粒經次氯酸鈉消毒的種子，澆入無菌水，待其發(fā)芽并持續(xù)培養(yǎng)4個月。

將篩選獲得的純菌在PDA培養(yǎng)基上重新活化，25 ℃培養(yǎng)7 d備用。將生長4個月的沙地云杉幼苗拔出，切斷少量根部，刮取約2 g培養(yǎng)好的菌根真菌菌絲接種至根部并將幼苗移栽至育苗缽中，育苗缽土壤為沙地云杉天然林土壤與蛭石按體積比1∶1混合的滅菌土壤。每個育苗缽中移栽1株沙地云杉幼苗，接種菌根真菌的沙地云杉分別以菌種編號表示，分別為YSF1、YSF2、YSF3、YSF5、YSF6、YSF7、YSF8、YSF9；以不接種的沙地云杉幼苗為空白對照，并以YSCK標識。每個處理10次重復，共9種處理，合計90株。將沙地云杉幼苗置于光照充足的試驗大棚中，培養(yǎng)溫度約為25 ℃，光照12 h·d-1，定時觀測并澆無菌水保持土壤濕潤。

2.2.4測定項目及指標

菌根真菌接種沙地云杉幼苗6個月后，全部拔出，將根際及根圍土壤風干待用。自來水清洗根部并用吸水紙吸干水分，從根基處測量沙地云杉株高；用剪刀從根基處剪斷，將幼苗地上部分和根放入烘箱，80 ℃烘干24 h測定干物質量。土壤有機質測定采用重鉻酸鉀法，全氮和全磷測定采用高氯酸-硫酸消化法，全鉀測定采用氫氟酸-高氯酸消化法，速效氮測定采用堿解擴散法，速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-分光光度法，速效鉀測定采用醋酸銨溶液浸提-原子吸收法。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，繪圖由Origin 8.6軟件完成。

3 結果與分析

3.1 菌根真菌的鑒定和種類組成

將沙地云杉的根段貼在培養(yǎng)基上進行菌根真菌的分離培養(yǎng)，共獲得8株菌根真菌。依據(jù)菌落形態(tài)觀察(圖1)。其中，YSF1為淡紅色菌落，菌落邊緣不規(guī)則；YSF2、YSF3和YSF9菌落為白色-淺棕相間，且有同心輪紋，邊緣整齊；YSF5菌落為淺棕-深棕相間，有同心輪紋，邊緣整齊；YSF6菌落為褐色，不規(guī)則邊緣；YSF7和YSF8菌落顏色不同，培養(yǎng)7 d均能平鋪整板，生長迅速，菌落邊緣不規(guī)則。

圖1 沙地云杉菌根真菌的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of mycorrhizal fungi from Picea mongolica

將獲得的菌根真菌ITS序列與GenBank中公布的親緣關系相近的菌種進行Blast在線比對，此8株菌分別為FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF2、Mycetinissp. YSF3、MarasmiusscorodoniusYSF5、Podosporasp. YSF6、AmbomucorsenatoinflatusYSF7、AmbomucorsenatoinflatusYSF8和Mycetinissp. YSF9。其中，2株歸于子囊菌門，4株歸于擔子菌門，2株歸于毛霉菌門；在目水平上，1株歸于肉座菌目，1株歸于糞殼菌目，4株歸于傘菌目，2株歸于毛霉目，傘菌目為優(yōu)勢目，占比50%。

3.2 促生作用分析

將分離獲得的純菌接種在PKO和硅酸鹽選擇性培養(yǎng)基上，觀察是否有菌落長出，初步分析其溶磷和溶鉀能力。結果表明(圖2、圖3)，菌株FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF3、Podosporasp. YSF6和AmbomucorsenatoinflatusYSF8能夠在PKO固體平板上長出，透明圈直徑與菌落直徑之比在 1.04～1.33 之間，其中Mycetinissp. YSF3具有最大圈徑比。Podosporasp. YSF6還能夠在硅酸鹽培養(yǎng)基上生長，但并未產生透明圈。

圖2 菌根真菌溶磷情況Fig.2 Phosphorus solubilization of mycorrhizal fungi

將8株菌根真菌接種至沙地云杉幼苗根部進行促生作用分析，結果表明(圖4)，接種Mycetinissp. YSF2和Mycetinissp. YSF9的沙地云杉幼苗株高分別比空白對照提高 5.15% 和 3.61%，但未達到顯著性差異，其他菌株在6個月生長期內對沙地云杉幼苗株高沒有明顯促進作用。由圖4可見，MarasmiusscorodoniusYSF5處理的沙地云杉地上部分干重比空白對照提高 20.44%，其他菌株均無顯著促進效果；而多數(shù)菌株能夠明顯促進根的生長，其中FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF2、MarasmiusscorodoniusYSF5、AmbomucorsenatoinflatusYSF7和Mycetinissp. YSF9分別比空白對照提高 53.68%、60.00%、67.37%、41.05% 和 32.11%，且YSF5達到顯著提高水平。由此說明，接種菌根真菌在6個月生長期內明顯提高了沙地云杉幼苗根的干物質量。

將沙地云杉幼苗連根拔出，收集根際及根圍土壤并測定養(yǎng)分含量。由表1可知，接種菌根真菌可明顯提高土壤有機質、全氮和速效氮的含量。與空白對照相比，接種菌根真菌后土壤有機質含量提高 23.99%～101.34%，全氮含量提高 27.27%～212.12%，速效氮含量提高 15.07%～52.48%。但接種菌根真菌對土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量無明顯影響。

注：不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

表1 不同處理沙地云杉根圍土壤養(yǎng)分含量Tab.1 Nutrient content of rhizosphere soil of Picea mongolica with different treatments

4 討論

菌根與沙地云杉長期共生，目前對沙地云杉外生菌根的研究主要集中于調查分類方面。尹彬[9]對沙地云杉外生菌根的宏觀形態(tài)和顯微結構進行觀察，并描述了Conococum、Cortinarius和Tomentella的外部形態(tài)特征。田慧敏[10]在白音敖包自然保護區(qū)調查中發(fā)現(xiàn)8種沙地云杉外生菌根真菌，分別為毒粘滑菇(Hebelomacrustiliniforme)、大孢滑銹傘(H.sacchriolens)、紅褐絲蓋傘(Inocybefriesii)、灰鎖瑚菌(Clavulinacinerea)、花形地星(Geastrumfloriforme)、小地星(G.minimum)、矮小地星(G.namum)和尖頂?shù)匦?G.triplex)。木蘭[11]進一步調查了白音敖包自然保護區(qū)沙地云杉外生菌根真菌，包括辣牛肝菌(Chalciporuspiperatus)、花形地星、橙黃疣柄牛肝菌(Leccinumaurantiacum)、褐疣柄牛肝菌(L.scabrum)、銅綠紅菇(Russulaaeruginea)、平滑紅菇(R.aquosa)、葡紫紅菇(R.azurea)、美味紅菇(R.delica)、異褶紅菇(R.heterophylla)、全緣紅菇(R.integra)、較小紅菇(R.minutula)、毒粘滑菇和草黃口蘑(Tricholomalascivum)13種。前人報道的沙地云杉外生菌根主要集中于滑菇屬(Hebeloma)、地星屬(Geastrum)和紅菇屬(Russula)。本研究中，共獲得皮傘屬(Mycetinis)3株，Ambomucor屬2株，鐮刀菌屬(Fusarium)、Podospora屬和小皮傘屬(Marasmius)各1株，皮傘屬為優(yōu)勢菌，這可能與采集的沙地云杉樹齡不同有關。有研究表明，植物在不同生長階段對養(yǎng)分的需求逐漸改變，通常隨著植物成年光合作用增強，對菌根真菌的依賴減弱，菌根真菌類群也隨之發(fā)生變化[12]。

本研究中，接種菌根真菌對沙地云杉的株高沒有顯著促進作用。沙地云杉自然生長緩慢，試驗時間短可能沒有明顯變化，后期將增加長期觀測實驗，進一步明確菌根真菌對沙地云杉株高的促進作用。此外，本研究中接種菌根真菌對土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量無明顯促進作用，僅對土壤有機質、全氮和速效氮含量明顯提升。Rillig[13]研究表明，外生菌根真菌不僅能夠從寄主植物根系獲取大量碳源，同時也能夠釋放更多的碳源到土壤中，菌根真菌更高的分泌速率導致輸入土壤中的碳通量更大。此外，還有研究表明，菌根有助于植物對土壤氮素的積累[14]。外生菌根真菌可通過產生氮降解酶來獲得更豐富的有機氮源[15]。Jargeat等[16]研究表明，宿主植物根系全氮的 75% 均來自于與其共生的根外菌絲吸收的氮素。張哲超等[17]在小果白刺(Nitrariasibirica)根部接種叢枝菌根，與對照組相比，接種處理顯著增加了土壤有機碳含量，還使得土壤全氮含量顯著提高了 152.54%。因此，接種菌根真菌對于土壤有機質和氮素提升發(fā)揮了重要作用。土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量提升不明顯可能與取樣以及試驗短期效應有關，本研究中將沙地云杉根際和根圍土壤混合后測定土壤養(yǎng)分，根圍土壤對于根際效應響應不強烈，可能是導致土壤養(yǎng)分提升不明顯的重要因素[18]，而試驗周期較短也會對土壤養(yǎng)分的改善效果不明顯。

5 結論

沙地云杉根段多數(shù)會定殖菌根真菌，其中皮傘屬為優(yōu)勢菌屬。接種菌根真菌明顯提高了沙地云杉幼苗根的干物質量、土壤有機質、全氮和速效氮含量，分別提高 14.74%～67.37%、23.99%～101.34%、27.27%～212.12% 和 15.07%～52.48%?？傮w而言，MarasmiusscorodoniusYSF5具有更強的促生能力，Mycetinissp. YSF2、AmbomucorsenatoinflatusYSF7和Mycetinissp. YSF9次之。這些菌株可作為沙地云杉育苗和造林的菌種資源儲備。