帕成周 張貫啟 鄔善敏

原發(fā)性肝癌是我國第4位常見的惡性腫瘤，在腫瘤致死病因中位居第2位[1]。近年來肝癌在男性和女性中的發(fā)生率均有不同程度的增加，其5年生存率為18%[2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌類型，進展至晚期時預(yù)后極差，僅有5%～10%的早期患者具備手術(shù)切除的條件[3]。

DNA損傷通常是由多種內(nèi)源性和外源性因素引起的，如紫外線、輻射、化學(xué)因素、活性氧、DNA復(fù)制錯誤等。當(dāng)發(fā)生DNA單鏈或雙鏈斷裂時會引起基因組不穩(wěn)定，基因組不穩(wěn)定性被廣泛認為是腫瘤的標志性特征之一，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[4]。為了對抗DNA損傷，機體啟動損傷修復(fù)機制來修復(fù)和維持基因組的穩(wěn)定性，DNA單鏈斷裂時進行堿基異常修復(fù)(base-excision repair, BER)，DNA雙鏈斷裂則可通過非同源末端鏈接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HR)方式進行修復(fù)[5, 6]。RAD51是HR修復(fù)DNA雙鏈斷裂的關(guān)鍵蛋白之一，在前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)腸癌中發(fā)揮致癌基因的作用[7～13]。然而，RAD51表達在肝細胞癌中的臨床價值和生物學(xué)功能尚未完全闡明。本研究旨在探討RAD51表達與HCC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探究其表達與肝癌SMMC-7721細胞增殖、遷移侵襲能力的關(guān)系。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)獲取及生存分析：2020年6月使用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(https:∥portal.gdc.cancer.gov/)下載HCC患者臨床資料和RNA-seq表達數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集包括374例HCC組織和50例癌旁組織。根據(jù)RAD51的中位表達將HCC患者分為高低表達兩組，使用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站(https:∥kmplot.com/analysis/)進行生存分析。

2.細胞系及主要實驗材料：人正常肝細胞系L02和人肝癌細胞系SMMC-7721(中國科學(xué)院細胞庫)、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)、10%胎牛血清(美國HyClone公司)、RAD51 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)、RAD51抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、CCK-8檢測試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司)。細胞放置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱，待細胞貼壁繁殖達培養(yǎng)瓶底部面積80%左右用胰酶細胞消化液進行消化傳代。

3.實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)：將細胞硏磨裂解后加入1ml Trizol Reagent抽提總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系并進行定量PCR反應(yīng)，采用2-ΔΔCT法計算RAD51 mRNA相對表達量。內(nèi)參基因 GAPDH及RAD51引物序列詳見表1。

表1 引物序列

4.細胞轉(zhuǎn)染及篩選：細胞轉(zhuǎn)染采用小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建RAD51敲低質(zhì)粒，設(shè)計3條si-RAD51干擾序列，設(shè)置SMMC-7721正常對照組(Control組)、空載組(si-NC組)、轉(zhuǎn)染組(si-RAD51-1、si-RAD51-2、si-RAD51-3組)共5組。將SMMC-7721細胞接種在6孔板上，采用lipofectamin 2000方法在無血清培養(yǎng)基中進行細胞轉(zhuǎn)染，溫育6h后更換新鮮含血清培養(yǎng)基，溫育48h后收集細胞用于qPCR和 Western blot法篩選出干擾效果最佳的轉(zhuǎn)染組細胞系。以Control組、si-NC組、干擾最佳si-RAD51組進行生物學(xué)功能實驗。

5.CCK-8增殖實驗：根據(jù)CCK-8檢測試劑盒說明書進行實驗，測定48h各組SMMC-7721細胞存活率。

6.Transwell遷移及侵襲實驗：遷移實驗將處理后的各組細胞加入200μl的無血清培養(yǎng)基分別配制成含有2×104個的細胞懸液, 接種于Transwell小室上室；侵襲實驗將各組細胞配制成含有2.5×104個的細胞懸液，接種于BD matrigel和RPMI-1640以1∶3的比例制備而成的侵襲小室上室。下室加入500μl 含10% FBS的完全培養(yǎng)基，在37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出，PBS洗去培養(yǎng)基，結(jié)晶紫染色10min，擦除干凈，顯微鏡下隨機選取3個視野拍照。

7.基因集富集分析：基因集富集分析使用GSEA軟件(v.4.0.3，https:∥www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)進行，以“c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt”, “c5.all.v7.1.symbols.gmt” 作為參考數(shù)據(jù)集，隨機運行次數(shù)設(shè)置為1000，以P<0.01、FDR<0.05作為過濾條件，進行GO功能注釋和KEGG通路分析。

8.統(tǒng)計學(xué)方法：采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩獨立樣本的差異采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.RAD51 mRNA表達結(jié)果：利用TCGA分析發(fā)現(xiàn)，RAD51 mRNA在HCC組織中的表達水平明顯高于鄰近正常肝組織(t=6.35,P<0.01, 圖1A)。通過qPCR分析RAD51 mRNA在L02和SMMC-7721中的表達情況，結(jié)果顯示RAD51 mRNA在肝癌細胞系中表達顯著高于正常肝細胞系(t=6.96,P<0.01, 圖1B)。

圖1 RAD51 mRNA在肝細胞癌組織和細胞中的表達情況A.TCGA數(shù)據(jù)庫中組織水平表達情況；B.細胞系水平表達情況

2.RAD51 mRNA表達與HCC患者臨床特征：RAD51 mRNA表達水平在年齡(<60歲 vs ≥60歲，P<0.01，圖2A)、病理分級(G1和2 vs G3和4，P<0.01，圖2C)、臨床分期(stageⅠ vs stage Ⅱ和stageⅠ vs stage Ⅲ和Ⅳ，P<0.01，圖2D)、T分期(T1vs T2、T1vs T3、T1vs T4，P<0.05，圖2E)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 RAD51 mRNA表達與HCC患者臨床特征的關(guān)系A(chǔ).年齡；B.性別；C.病理分級；D.臨床分期；E.T分期；F.N分期

3.RAD51 mRNA表達與預(yù)后：利用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站根據(jù)RAD51表達中位值將HCC患者分為高低表達兩組進行生存分析，RAD51低表達的HCC患者總生存期(overall survival, OS)優(yōu)于高表達的HCC患者(HR=1.62, 95% CI:1.14～2.30,P<0.01，圖3)。其中，RAD51低表達組患者的中位生存時間為70.5個月；高表達組的中位生存時間為45.7個月。此外，通過單因素和多因素COX分析驗證了RAD51表達是否為HCC患者OS的獨立預(yù)后因素。單因素COX分析顯示，RAD51表達、臨床分期、腫瘤直徑、遠處轉(zhuǎn)移與HCC患者的OS密切相關(guān)(表2)；在多因素COX分析中進一步提示RAD51表達是OS的獨立預(yù)后指標(HR=1.31, 95% CI:1.10～1.55,P<0.01)。

圖3 RAD51 mRNA表達與HCC患者預(yù)后的生存曲線

表2 單因素COX分析HCC患者臨床特征和總體生存率的相關(guān)性

4.干擾效率的驗證結(jié)果：將3條RAD51干擾序列轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細胞，通過qPCR和 Western blot法檢測其mRNA表達改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SMMC-7721細胞中，si-RAD51-1組、si-RAD51-3組與Contorl組比較RAD51 mRNA表達水平明顯降低(F=40.6,P<0.01，圖4)。其中si-RAD51-3干擾效果最佳，選擇此干擾作為后期實驗組研究對象。

圖4 干擾載體在SMMC-7721細胞干擾效率的驗證A.qPCR；B.Western blot法檢測;與Control組比較, *P<0.05, **P<0.01，#P>0.05

5.增殖實驗結(jié)果：48h CCK-8實驗結(jié)果表明， si-RAD51組細胞存活率顯著低于Control組、si-NC組細胞存活率(F=27.9，P<0.01，圖5)。

圖5 沉默RAD51后SMMC-7721細胞的存活率與Control組比較,*P<0.01，#P>0.05

6.Transwell小室實驗結(jié)果：si-RAD51組與Control組、si-NC組比較，SMMC-7721細胞的遷移能力受到抑制(F=39.8，P<0.01)，侵襲能力也受到抑制(F=11.1，P<0.01，圖6)。

圖6 沉默RAD51后SMMC-7721細胞Transwell小室實驗(×200)A.Transwell遷移實驗；B.Transwell侵襲實驗；與Control組比較, * P<0.01，#P>0.05

7.GSEA基因集富集分析結(jié)果：通過GSEA進行RAD51基因GO功能注釋和KEGG通路分析，結(jié)果顯示HCC中與RAD51高表達相關(guān)的15個顯著富集的GO功能注釋和KEGG通路。RAD51主要位于染色體著絲粒區(qū)域，具有基因沉默、DNA包裝、DNA復(fù)制、mRNA結(jié)合、細胞周期調(diào)控等分子功能，參與細胞周期的負調(diào)控、p53介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控基因表達等生物學(xué)過程。RAD51基因可能在細胞周期、核苷酸切除修復(fù)、剪接體、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、同源重組、N-聚糖生物合成、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、p53信號通路等通路中發(fā)揮作用。

討 論

RAD51基因位于染色體15q15.1上，由13個外顯子組成，編碼RAD51蛋白家族成員，參與HR和DNA修復(fù)[14]。它與5個RAD51樣基因XRCC2、XRCC3、RAD51B(RAD51L1)、RAD51C(RAD51L2)和RAD51D(RAD51L3)在基因修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[15]。然而，RAD51在HCC中的臨床意義和生物學(xué)功能仍有待研究。

本研究發(fā)現(xiàn)RAD51 mRNA在HCC組織中表達上調(diào)，同時，RAD51在肝癌SMMC-7721細胞中的表達顯著高于正常肝L02細胞。生存分析數(shù)據(jù)顯示，RAD51高表達組與低表達比較，其總體生存期更差。多因素COX分析中進一步提示RAD51表達水平可以作為HCC患者的獨立預(yù)后指標。人類癌癥的病程是由解剖學(xué)上的疾病階段和腫瘤生長速度決定的。TNM分期通過腫瘤直徑(T分期)、有無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)及有無遠處轉(zhuǎn)移(M分期)來確定腫瘤的進展程度。探索RAD51 mRNA表達水平與HCC患者臨床特征關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)RAD51表達增加與更高的病理分級、臨床分期和腫瘤直徑相關(guān)，提示RAD51高表達可能促進腫瘤進展。本研究結(jié)果顯示RAD51 mRNA表達水平與HCC患者有無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān)，但相關(guān)研究表明高表達的RAD51在乳腺癌中可以促進局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生[16, 17]。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于在HCC患者臨床特征數(shù)據(jù)中N分期的病例數(shù)缺失較多(占比30.8%)所致，需在實驗研究和實際工作中進一步驗證。

此外，筆者還進行了體外細胞學(xué)實驗來研究RAD51的表達對肝癌細胞生物學(xué)功能的影響。本研究利用siRNA沉默肝癌SMMC-7721細胞中RAD51的表達，探討RAD51與肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的關(guān)系。48h CCK-8實驗結(jié)果顯示抑制RAD51后SMMC-7721細胞的增殖能力下降，Transwell細胞實驗結(jié)果顯示沉默RAD51后，無論是遷移細胞數(shù)還是侵襲細胞數(shù)均明顯減少，提示沉默RAD51可以抑制SMMC-7721細胞的遷移侵襲能力。本研究通過基因集富集分析明確了RAD51基因的功能及其發(fā)揮生物學(xué)作用的可能通路。RAD51主要位于染色體著絲粒區(qū)域，具有基因沉默、DNA包裝、DNA復(fù)制、mRNA結(jié)合等功能，參與p53介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及周期負調(diào)控，與現(xiàn)有關(guān)于RAD51結(jié)構(gòu)和分子功能的研究結(jié)果基本一致。RAD51的高表達在HCC中富集于p53、N-聚糖生物合成、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等通路，這些生物學(xué)過程的異常已被證實與癌癥進展有關(guān)。細胞蛋白的降解是一個復(fù)雜且精細的過程，絕大多數(shù)依賴泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進行，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的水解異常致使細胞周期次序及細胞內(nèi)環(huán)境紊亂，與細胞轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[18]。近年來有研究表明RAD51可以指導(dǎo)癌癥患者的臨床治療及評估療效[19～21]。隨著我國人口老齡化趨勢愈加明顯，部分難以耐受手術(shù)者或腫瘤復(fù)發(fā)難以切除者需進行手術(shù)以外的其他手段治療。抑制RAD51的表達可以改善腫瘤患者化療、放療耐受的情況，這一現(xiàn)象發(fā)生在乳腺癌、鼻咽癌、食管癌等多種惡性腫瘤疾病中[22～26]。RAD51的表達還與內(nèi)分泌治療、免疫治療相關(guān)，抑制RAD51的表達可能對腫瘤治療的方式及手段產(chǎn)生影響，具有重要的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究結(jié)果提示RAD51高表達與HCC患者更高的病理分級、臨床分期密切相關(guān)，是影響總體生存預(yù)后的獨立危險因素，沉默其表達可顯著抑制肝癌SMMC-7721細胞的增殖、遷移及侵襲能力。在未來，關(guān)于RAD51的臨床應(yīng)用和轉(zhuǎn)化研究將有助于更好地了解同源重組在惡性腫瘤中的作用。