向勁，程小飛，謝敏，李金龍，宋銳，彭治桃

（湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長沙 410153）

四大家魚（草魚、鰱、鳙、青魚）是我國淡水池塘養(yǎng)殖的主要種類，其產(chǎn)量一直保持在淡水魚總量的50%以上，發(fā)揮著重要的經(jīng)濟(jì)與社會價(jià)值[1]。但是，其生產(chǎn)方式大多呈現(xiàn)出重產(chǎn)出而輕養(yǎng)水的特點(diǎn)[2,3]。近十多年，從清淤、生物浮床、魚種搭配、改善設(shè)施、潑灑調(diào)水劑等多個(gè)角度開展試驗(yàn)，以解決池塘養(yǎng)殖中增效、節(jié)能、減排的兼顧問題[4-6]。其中，以微生物制劑調(diào)節(jié)池塘水質(zhì)的研究起步較晚。大量研究表明，良好的微生態(tài)環(huán)境對池塘養(yǎng)殖具有重要意義[7-14]。其研究方法多以進(jìn)行養(yǎng)殖效果對比為主，輔以監(jiān)測水體氮磷、溶氧、葉綠素Chl-a 水平等理化指標(biāo)，但利用池塘浮游生物群落變化評價(jià)微生物制劑調(diào)水功能的研究鮮有報(bào)道。

水生態(tài)系統(tǒng)中浮游植物群落與微生物具有直接和間接的相互影響關(guān)系[15-17]。為了進(jìn)一步認(rèn)識微生物群落對浮游植物群落的生態(tài)影響及總氮總磷在其中的作用，本文在精養(yǎng)塘中以不同用法施用微生物制劑，監(jiān)測各時(shí)期的浮游植物群落變化，比較分析家魚精養(yǎng)池中浮游植物群落對微生物調(diào)水劑的生態(tài)響應(yīng)及其原因，以期為池塘養(yǎng)殖的水質(zhì)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)，為微生物制劑對浮游植物的影響研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)在湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所家魚養(yǎng)殖基地的3 個(gè)面積為8×667 m2魚池（潑菌組、加磷潑菌組、對照組）中進(jìn)行。試驗(yàn)魚池年初各放草魚Ctenopharyngodon idellus 1 400 kg、濾食性魚類700 kg，且水源、魚池形狀方位、水深和投飼管理等條件均一致。2018 年8 月24 日潑菌組池塘均勻潑灑紅糖活化2 h 后的EM 菌及芽孢桿菌75 g/667 m2；加磷潑菌組池塘先后潑灑過磷酸鈣（有效P2O5為500 g/667 m2）及紅糖活化2 h 后的EM菌及芽孢桿菌75 g/667 m2；對照組池塘僅潑灑紅糖溶劑（紅糖質(zhì)量等于前兩組用于菌類活化的量）。試驗(yàn)期間，3 個(gè)池塘均不換水及補(bǔ)水。2018 年8 月23 日（潑菌前）和9月3 日（潑菌后）晴天多云上午，參照《內(nèi)陸水域漁業(yè)自然資源調(diào)查手冊》[18]分別采集這3 個(gè)池塘水樣。

1.2 樣品處理及數(shù)據(jù)分析

1.2.1 浮游植物定性

將25#浮游生物網(wǎng)掛上竹棍并綁定，在水體不同深度做“∞”形循回拖動(dòng)，然后將網(wǎng)內(nèi)濃縮的水樣放入50 mL 的標(biāo)本瓶中固定。帶回實(shí)驗(yàn)室后用滴管汲取適量樣品制成標(biāo)本片，在光學(xué)顯微鏡下觀察浮游植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征以進(jìn)行屬、種的鑒定。

1.2.2 浮游植物定量

用1 L 容量的Palatas 采水器對截面三個(gè)點(diǎn)（長邊塘埂的兩側(cè)中間點(diǎn)及池塘中心）采集混合水樣3 L，現(xiàn)場使用魯哥氏液（1%）搖勻固定，帶回實(shí)驗(yàn)室靜置，收集濃縮液后定容到50 mL。將濃縮水樣充分搖勻后，滴取0.1 mL 于生物計(jì)數(shù)框，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并根據(jù)公式計(jì)算出浮游植物密度（cells·L-1）。浮游植物生物量是由浮游植物密度與對應(yīng)的浮游植物細(xì)胞平均濕重值相乘得到，但是，主要種必須先用體積法進(jìn)行實(shí)際測量，然后以每109μm3體積換算為1 mg 鮮藻重，即求得生物量（mg·L-1）[19]。

1.2.3 總氮、總磷的測定

采集水樣時(shí)現(xiàn)場測量池塘水溫并記錄，8 月23日水溫為31.8℃，9 月3 日水溫為28.6℃?？偟═N）和總磷（TP）的測定方法分別為堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB11894-89）和過硫酸鉀消解鉬酸銨分光光度法（GB11893-89）。

1.2.4 物種多樣性分析

淡水浮游植物生物多樣性分析的方法有多種，使用一種多樣性指數(shù)常會造成分析結(jié)果不夠完善[20]，本文同時(shí)采用Simpson 多樣性指數(shù)（D）和Shannon-Wiener 指數(shù)（H）兩種方法分析3 組水體的物種多樣性，其公式分別為：

式中，S 為物種的數(shù)目（種數(shù)），Pi為種i 的個(gè)體在全部個(gè)體中的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮游植物群落的定性分析

試驗(yàn)期間，3 個(gè)魚池共觀察到浮游植物81 種（屬），其中綠藻門最多，為35 種，占種類總數(shù)43%；其次為藍(lán)藻門23 種，占28%；硅藻門10 種，占12%；其他門的種類數(shù)較少（圖1）。

圖1 浮游植物種類組成Fig.1 Species composition of phytoplankton

圖2 為試驗(yàn)前后兩次（8 月和9 月）各池的浮游生物種類數(shù)分布。由圖2 可知，浮游植物種類數(shù)最多及最少均出現(xiàn)在9 月，加磷潑菌組（9 月）浮游植物種類數(shù)最多，為61 種；對照組（9 月）種類數(shù)最少，為52 種。潑菌組的浮游植物由8 月的57 種增長到9 月的58 種，略有增長；加磷潑菌組由8 月的56 種增長到9 月的61 種，增長比較明顯，其中主要是綠藻門由26 種增長到31 種；而對照組的種類數(shù)由8月的56 種減少到9 月的52 種，綠藻、藍(lán)藻和硅藻門種類數(shù)均有減少。

圖2 各組水體試驗(yàn)前后的浮游植物門類分布Fig.2 The prevalence frequency of phytoplankton in phylum in water of each group before and after the experiment

2.2 浮游植物群落的定量結(jié)果

3 個(gè)試驗(yàn)組水體中浮游植物密度范圍為5.97×107～15.89×107cells·L-1，最低值出現(xiàn)在8 月（試驗(yàn)前）的對照組，最高值出現(xiàn)在9 月（試驗(yàn)后）的加磷潑菌組。由圖3 可知，試驗(yàn)期間3 組水體浮游植物密度變化趨勢一致，變動(dòng)幅度差距較小。

圖3 不同試驗(yàn)組水體中浮游植物密度的變化趨勢Fig.3 The variations in phytoplankton density in water in various groups

3 個(gè)試驗(yàn)組水體中浮游植物生物量范圍為7.65～18.03 mg·L-1，最低值出現(xiàn)在8 月潑菌組，最高值出現(xiàn)在8 月對照組。前后生物量變化見圖4，對照組的浮游植物生物量減少，而潑菌組和加磷潑菌組的水體浮游植物生物量在試驗(yàn)期間均有增長。

圖4 不同試驗(yàn)組水體中浮游植物生物量變化趨勢Fig.4 The variations in phytoplankton biomass in water in various groups

表1 為3 組水體試驗(yàn)前后浮游植物各門對整體生物量的貢獻(xiàn)度變化，潑菌組的綠藻門和硅藻門大幅增長，裸藻門大幅減少；加磷潑菌組的藍(lán)藻門和綠藻門增長明顯，硅藻門有所減少；對照組各門變化不大，藍(lán)藻門生物量始終保持在較高水平，僅硅藻、裸藻門明顯減少。

表1 不同試驗(yàn)組水體中浮游植物各門生物量變化Tab.1 Biomass changes in each phylum of phytoplankton in water in various groups

現(xiàn)將水體中藻類平均體質(zhì)量K 值[21]（K=生物量/密度）作為單個(gè)浮游植物平均大小的參考值，即K 值越大，個(gè)體越大，K 值越小，個(gè)體平均越小。3 組水體中浮游植物相對大小的比較結(jié)果見圖5。由圖5 可知，試驗(yàn)期間潑菌組的K 值略有減少，加磷潑菌組基本不變，對照組大幅減小，反映出對照組水體的浮游植物個(gè)體明顯趨于小型化，而潑菌組與加磷潑菌組的變化不明顯。

圖5 不同試驗(yàn)組水體中浮游植物的平均體質(zhì)量K 值的變化趨勢Fig.5 The variation in average weight K value of phytoplankton in water in various groups

2.3 主要種

試驗(yàn)期間3 組水體共7 種主要種（表2），其中藍(lán)藻門5 種，綠藻門2 種。試驗(yàn)開始時(shí)（8 月），潑菌組的主要種為藍(lán)藻門的不定微囊藻Microcystis incerta 和銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（9 月），主要種為藍(lán)藻門的微小平裂藻Merismopedia tenuissima 和綠藻門的單角盤星藻Pediastrum simplex。加磷潑菌組在試驗(yàn)開始時(shí)主要種為藍(lán)藻門的不定微囊藻、銅綠微囊藻、細(xì)浮鞘絲藻Planktolyngbya subtilis 和綠藻門的單角盤星藻；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，主要種為藍(lán)藻門的不定微囊藻、細(xì)浮鞘絲藻以及綠藻門的單角盤星藻、纖細(xì)新月藻Closterium gracile Breb.。試驗(yàn)開始時(shí)對照組的主要種為藍(lán)藻門的不定微囊藻、銅綠微囊藻（和節(jié)旋藻Arthrospira platensis；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，主要種為藍(lán)藻門的不定微囊藻、銅綠微囊藻和微小平裂藻。

表2 試驗(yàn)前后不同試驗(yàn)組水體中浮游植物主要種的分布與變化Tab.2 Distribution and variation of main species phytoplankton in water in various groups before and after the experiment

主要種的生態(tài)指示作用具有一定積極意義，在使用上較為直觀且簡便[22]，現(xiàn)將各水體中的藻類主要種作為水環(huán)境類型的指示生物[23-26]。藍(lán)藻門5 種為富營養(yǎng)型或中-富營養(yǎng)型，綠藻門2 種為中營養(yǎng)和寡污型指示生物，后者對水環(huán)境的質(zhì)量要求明顯高于前者。現(xiàn)以藍(lán)藻門和綠藻門分門計(jì)數(shù)，試驗(yàn)前后對照組無變化，均為藍(lán)藻門；潑菌組和加磷潑菌組主要種在試驗(yàn)后均比試驗(yàn)前增加了綠藻門的1 種。

2.4 多樣性指數(shù)

由表3 可知，試驗(yàn)期間，潑菌組的Simpson 多樣性指數(shù)從0.839 略降至0.822，另兩組的Simpson 指數(shù)則有所增大；3 組水體的Shannon-Wiener 指數(shù)均有所增大，未見差異。整體來說，3 組水體的浮游植物生態(tài)系統(tǒng)均較穩(wěn)定。

表3 不同試驗(yàn)組水體中浮游植物多樣性指數(shù)變化Tab.3 Variation in phytoplankton diversity index in water in various groups

2.5 水體中總氮總磷含量的變化及其比值

由圖6 可知，試驗(yàn)期間3 組水體的總氮（TN）含量變化趨勢是：對照組小幅增加，而潑菌組與加磷潑菌組的TN 含量急劇下降。增加外源性磷有促進(jìn)對藻類增殖的作用，當(dāng)輸入磷含量達(dá)到1.65 mg·L-1時(shí)，促進(jìn)作用消失[27]。本試驗(yàn)中3 組水體前后測量的總磷（TP）含量均低于1.65 mg·L-1，說明水體并未達(dá)到磷飽和狀態(tài)。由圖7 可知，潑菌組與對照組總磷TP 含量大幅減少，加磷潑菌組在試驗(yàn)期間對水體補(bǔ)充了過磷酸鈣，導(dǎo)致TP 含量減少幅度相對較少。

圖6 總氮（TN）變化趨勢Fig.6 The changes in total nitrogen（TN）levels

圖7 總磷（TP）變化趨勢Fig.7 The change in total phosphorus（TP）levels

水中的氮磷比值可初略判斷限制浮游植物生長的營養(yǎng)物質(zhì)是氮元素還是磷元素[28]。當(dāng)水體中的N/P 值大于20 時(shí)，被認(rèn)為是P 限制，比值位于10～20 之間時(shí)，限制性因素并不明確，比值低于10時(shí)，被認(rèn)為是N 限制[29,30]。試驗(yàn)中3 組水體的氮磷比值（N/P）前后變化分別為：潑菌組5.9～8.5，均小于10，為氮限制型水體；加磷潑菌組11.3～11.7，均在10～20 之間；對照組12.5～38.2，前值于10～20 之間，后值大于20，為磷限制型水體。

3 討論

3.1 微生物制劑對總氮（TN）變化的影響

關(guān)于微生物制劑對水體總氮（TN）的影響，以往的研究結(jié)果較為一致。魏逸峰等[31]在凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei 苗養(yǎng)殖中使用微生物制劑，結(jié)果顯示，養(yǎng)殖環(huán)境中總氮含量低于未添加微生物制劑組。張悅[32]監(jiān)測了西安滬灞生態(tài)區(qū)不同富營養(yǎng)化類型的水體氮含量，發(fā)現(xiàn)微生物與總氮含量呈顯著相關(guān)關(guān)系。王新等[33]在南美白對蝦養(yǎng)殖后期進(jìn)行微生物制劑試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2 周后水體總氮去除率達(dá)到34.1%以上，并通過監(jiān)測養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌群落變化，推測微生物制劑主要以調(diào)控養(yǎng)殖池中的原有微生物群落以達(dá)到其凈水效果。本試驗(yàn)中，對照組水體中的總氮含量增加，而潑菌組與加磷潑菌組均有所下降，與上述結(jié)果完全一致，即微生物調(diào)水劑在短時(shí)期內(nèi)能降低水體總氮含量。

3.2 微生物制劑對總磷（TP）含量的影響及補(bǔ)充磷元素的調(diào)水效果差異

在以往的研究中，多同步監(jiān)測總磷監(jiān)測與總氮，結(jié)果中微生物制劑能有效降低總氮含量和總磷含量。張文斌等[34]從沉積微生物角度試驗(yàn)提出有藻條件下，沉積微生物的活性越強(qiáng)，沉積物中氮磷的釋放量越大，即水體中氮磷含量越高。鮮瑩[35]在富營養(yǎng)稻漁養(yǎng)殖水體中使用微生物制劑，發(fā)現(xiàn)篩選、擴(kuò)培出的有較強(qiáng)產(chǎn)胞外堿性磷酸酶和蛋白酶能力的菌株能降低水體氮磷含量。謝永斌[36]對鯉Cyprinus carpio 養(yǎng)殖池塘進(jìn)行為期28 d 的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)使用微生物制劑的池塘總氮總磷均低于未使用微生物制劑的池塘，且總磷差異顯著（P＜0.01）。但是，本試驗(yàn)中，3 組水體的總磷含量均降低，變化趨勢無差異，或可由底泥擾動(dòng)對水體中磷遷移和轉(zhuǎn)化的作用大于藻這一結(jié)論進(jìn)行解釋[37]。而使用微生物制劑的池塘與未使用微生物制劑的池塘的總磷變化趨勢無規(guī)則，或由3 組水體中的氮磷比差異引起。水體中氮磷變化受到微生物、浮游生物及其他生態(tài)、理化因子的共同影響，而氮磷比又能反過來影響這些生態(tài)進(jìn)程。如對云南洱海過去20 余年的水質(zhì)研究中，總磷對浮游生物的相對重要度在持續(xù)攀升，說明水體中浮游植物對氮磷的需求量是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程[38]。還有研究發(fā)現(xiàn)，水體中氮磷比不同會導(dǎo)致浮游植物群落分布及對氮和磷元素的利用效率也不一致[39-42]，氮磷比能影響微生物的硝化作用進(jìn)而影響氮磷元素分布[43]。為探究補(bǔ)充磷元素對調(diào)水效果的影響，本研究單獨(dú)比對了潑菌組和加磷潑菌組前后的主要種分布，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，潑菌組的主要種為藍(lán)藻門的微小平裂藻和綠藻門的單角盤星藻，加磷潑菌組的主要種為藍(lán)藻門的不定微囊藻、細(xì)浮鞘絲藻以及綠藻門的單角盤星藻、纖細(xì)新月藻。纖細(xì)新月藻（寡污）僅成為加磷潑菌組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的主要種，表明在對精養(yǎng)水體（尤其是N/P 值高于10）使用微生物調(diào)水制品時(shí)，適量補(bǔ)磷，降低氮磷比有助于促進(jìn)水體營養(yǎng)物質(zhì)的利用與轉(zhuǎn)化，間接優(yōu)化水環(huán)境質(zhì)量。

3.3 微生物制劑對浮游植物群落的影響

關(guān)于微生物制劑對浮游植物群落影響的報(bào)道較多，大多認(rèn)為，微生物制劑能促進(jìn)有益藻、抑制有害藻生長達(dá)到調(diào)節(jié)藻相的作用，進(jìn)而優(yōu)化水生態(tài)環(huán)境[44]。具體分析微生物制劑對浮游植物各門類分布的影響，鄭俠飛[45]的單藻種培育試驗(yàn)表明，微生物制劑能顯著促進(jìn)綠藻門的小球藻Chlorella vulgaris生長；陳書秀和王偉偉[46]研究顯示，微生物制劑對金藻、硅藻、綠藻的生長有促進(jìn)作用。與上述研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)中對照組的浮游植物種類數(shù)由56種減少到52 種，而使用微生物制劑的潑菌組和加磷潑菌組均有增長，均為綠藻門種類；對照組的浮游植物生物量和綠藻門生物量略降，而潑菌組及加磷潑菌組生物量均小幅增長，主要由綠藻門增長。微生物制劑在短期范圍內(nèi)提高了精養(yǎng)水體的浮游植物種類數(shù)和生物量，且主要是由提高綠藻門種類數(shù)及生物量造成。

3 組水體的藻類多樣性（Simpson 和Shannon-Wiener）指數(shù)均較穩(wěn)定，變化趨勢無差異。對照組的藻類平均體質(zhì)量K 值由3.02 急劇減少到1.24，而潑菌組與加磷潑菌組的K 值無明顯變化，反映出微生物制劑可阻止精養(yǎng)池中浮游植物的個(gè)體小型化。這很可能是微生物制劑中的芽孢桿菌、EM菌等對水體中微小型浮游植物的生長和繁殖產(chǎn)生競爭或抑制作用[47,48]，甚至是裂解浮游植物細(xì)胞[49]。

試驗(yàn)前后對照組池塘水環(huán)境的主要浮游植物種均屬中-富營養(yǎng)型的藍(lán)藻門，而潑菌組與加磷潑菌組在試驗(yàn)期間均增加1 種對水環(huán)境要求更高的綠藻門藻類。這與吳定心[13]的研究結(jié)果一致，表明微生物制劑在短期內(nèi)優(yōu)化了精養(yǎng)水體中的藻類群落生態(tài)結(jié)構(gòu)。

綜上所述，使用微生物制劑在短時(shí)期內(nèi)對精養(yǎng)水體的浮游植物密度、生物多樣性均無明顯影響，對種類數(shù)分布、生物量組成、平均體質(zhì)量K 值及主要種變化有較大影響且多為積極影響。在使用微生物制劑的同時(shí)潑灑適量磷肥調(diào)節(jié)氮磷比，改善池塘的磷限制型水體狀態(tài)，可促進(jìn)其調(diào)水效果。本文認(rèn)為，在微生物制劑對浮游植物群落變化產(chǎn)生影響的基礎(chǔ)上，可以同時(shí)監(jiān)測池塘中的微生物群落變化及更多水體理化因子，進(jìn)一步探究微生物群落與浮游生物群落在精養(yǎng)池中的生態(tài)聯(lián)系，為微生物制劑的應(yīng)用及池塘水質(zhì)管理提供參考。