李海潔，董小林，郭國軍，楊雪冰，林雅云，曹亞奇，李國喜，劉變枝

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 511400；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；4.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 鄭州 450008）

水質(zhì)是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生長和發(fā)育的重要因子。近年來，隨著我國高密度集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水體中殘餌、糞便等內(nèi)源性有機(jī)污染日趨嚴(yán)重，養(yǎng)殖水體中氨態(tài)氮（NH4+-N）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、化學(xué)需氧量（COD）等有毒有害物質(zhì)含量急劇增加，嚴(yán)重超標(biāo)，成了制約水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的主要因子[1,2]。水體中的非離子氨是氨氮對養(yǎng)殖生物的主要危害形式，其濃度直接反映水體氨氮的毒性。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中另一種常見的含氮毒性污染物，被視為養(yǎng)殖水域中誘發(fā)魚類爆發(fā)性疾病的重要因素和致病的根源[3]。COD 是反映水體中有機(jī)及無機(jī)氧化物污染的常用指標(biāo)，COD 含量高說明水體還原性物質(zhì)過高，水體受污染程度大，嚴(yán)重時造成魚類死亡[4,5]。養(yǎng)殖水體中有機(jī)氮（殘餌、代謝物）的不斷累積是水體中氮超標(biāo)的根本原因，亞硝酸鹽濃度和水體COD 含量與養(yǎng)殖過程中的殘餌、糞便以及肥料、浮游植物豐度等關(guān)系密切。因此，尋找安全、快速便捷的養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化處理技術(shù)，有效解決高密度養(yǎng)殖水體中水質(zhì)問題將是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的必然舉措，是目前水產(chǎn)從業(yè)人員亟待解決的問題。

在眾多養(yǎng)殖水體凈化技術(shù)中，微生態(tài)制劑以經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、安全、無抗藥性等成為養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境治理的熱門研究領(lǐng)域。芽孢桿菌Bacillus 分布廣、增殖快、抗逆性強(qiáng)，能分泌多種高活性的消化酶和抑菌物質(zhì),是現(xiàn)代微生物研究的熱門對象?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis，BS）是芽孢桿菌屬中研究和應(yīng)用較為廣泛的一種，是我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌，具有耐高溫、耐酸、耐鹽、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，可作為添加劑提高飼料利用效率、促進(jìn)機(jī)體健康，還具有消耗水體中有機(jī)物、抑制致病菌繁殖、凈化養(yǎng)殖水體的作用[6-8]，是水質(zhì)調(diào)控中常用的微生物種類。目前，有關(guān)枯草芽孢桿菌凈水效果的研究較多，但由于評價方法和試驗(yàn)周期不一致、試驗(yàn)方法不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)葐栴}，研究結(jié)果可比性差，部分研究菌株并非來自水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，評價中未能充分考慮水體自凈作用等，盡管目前市場上枯草芽孢桿菌產(chǎn)品較多，但市場現(xiàn)有枯草芽孢桿菌使用效果參差不齊，效果不穩(wěn)定。與物化法相比，生物脫氮法雖具有環(huán)保、安全等特點(diǎn)，但其凈水效果受菌株投放數(shù)量、菌株定植特性與定植能力、水體微生物種類與數(shù)量、水體營養(yǎng)物質(zhì)、水體理化指標(biāo)（如溶氧、溫度等）等多方面的影響。養(yǎng)殖中天氣、溫度、溶氧等環(huán)境因子改變均可導(dǎo)致上述因素改變，影響菌株的凈水能力。因此，篩選來源于養(yǎng)殖水體、降解效率高、起效快的有效發(fā)揮凈水作用的枯草芽孢桿菌菌株，對快速改善水質(zhì)，避免或緩解魚類急性中毒，保障水產(chǎn)養(yǎng)殖安全具有重要意義。

本試驗(yàn)評價廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心從養(yǎng)殖池塘中分離出的一株枯草芽孢桿菌在短時間對常規(guī)羅非魚養(yǎng)殖池塘水體的凈化效果，以期篩選快速、高效降解水體有害物質(zhì)的枯草芽孢桿菌菌株，為本土化微生物凈水產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌由廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心動保技術(shù)研究所從廣東海大集團(tuán)海鷗島基地養(yǎng)殖池塘中分離提供。正式試驗(yàn)前，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，制備濃度約109cfu/mL 的應(yīng)用菌液，冷藏備用。

試驗(yàn)用水取自廣東海大集團(tuán)股份有限公司研究中心海鷗島研究基地的常規(guī)羅非魚暫養(yǎng)塘。試驗(yàn)開始前，連續(xù)檢測池塘水質(zhì)指標(biāo)，至池水氨態(tài)氮（NH4+-N）含量為0.5007 mg/L，亞硝態(tài)氮（NO2--N）含量為0.0558 mg/L，化學(xué)需氧量（COD）6.9009 mg/L 時開展試驗(yàn)。

試驗(yàn)前，將池水抽入24 個有效水體積250 L 循環(huán)水養(yǎng)殖缸內(nèi)，循環(huán)12 h，然后取水樣檢測，確保各養(yǎng)殖缸內(nèi)水質(zhì)指標(biāo)完全一致后，停止水體循環(huán)，改為靜水，微曝氣，開始試驗(yàn)。整個試驗(yàn)過程中，試驗(yàn)缸內(nèi)不放置底泥、魚類等生物，不投餌。

1.2 方法

試驗(yàn)共設(shè)8 個處理組，分別量取0.25 mL（BS1）、1.25 mL（BS2）、2.5 mL（BS3）、12.5 mL（BS4）、25 mL（BS5）、62.5 mL（BS6）和125 mL（BS7）的應(yīng)用菌液，水體菌液終濃度分別為1×103cfu/mL、5×103cfu/mL、1×104cfu/mL、5×104cfu/mL、1×105cfu/mL、2.5×105cfu/mL 和5×105cfu/mL，每組3 個平行，以無添加組為空白對照（C 組）。試驗(yàn)進(jìn)行5 d。

試驗(yàn)期間，水溫保持在（29.2±0.6）℃，自然光照，微管曝氣。試驗(yàn)開始后第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 的早上7：00，利用虹吸法在水面下方30 cm 處采集水樣，測定氨態(tài)氮（NH4+-N）含量、亞硝態(tài)氮（NO2--N）含量和化學(xué)需氧量（COD）。所取水樣保存在4℃冰箱待測，當(dāng)天測定完畢。

NH4+-N含量按照HJ 535-2009 標(biāo)準(zhǔn)采取納氏試劑分光光度法測定；NO2--N 含量按照GB 7493-87 標(biāo)準(zhǔn)采用N-（1-萘基）-己二胺分光光度法測定；COD 含量按照按GB 11892-89 標(biāo)準(zhǔn)采用酸式高錳酸鉀指數(shù)法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS（20.0）軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)經(jīng)齊性檢驗(yàn)（Homogeneity of variances）后，采用one-way ANOVA 方法做一元方差分析。若數(shù)據(jù)差異顯著，則進(jìn)行Duncan’s 多重比較（Duncan’s multiple range test），P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度枯草芽孢桿菌對水體NH4+-N含量的影響

由表1 可知，各組水體中NH4+-N含量均隨時間延長而顯著上升至最高后下降（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)束時添加濃度≥1×105cfu/mL 組仍顯著高于初始水平（P＜0.05）。同一時間，添加劑量≥2.5×105cfu/mL時1 d 內(nèi)顯著降低水體NH4+-N含量（P＜0.05），隨后水體NH4+-N含量明顯反彈，前期降幅越大，后期反彈幅度越大（P＜0.05）。在同一取樣時間，對照組NH4+-N含量為基準(zhǔn)計(jì)算得到的去除率，表明高劑量添加下短期內(nèi)可有效去除水體NH4+-N，后期出現(xiàn)反彈（圖1）。

表1 不同濃度BS 對水體NH4+-N 含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Tab.1 Effect of different concentrations of BS on ammonia-nitrogen content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

圖1 各取樣時間點(diǎn)以對照組為基準(zhǔn)的NH4+-N去除率Fig.1 Removal rate of NH4+-N at each sampling time compared with the control group

2.2 不同濃度枯草芽孢桿菌對水體NO2--N含量的影響

由表2 可知，盡管各組水體NO2--N 含量均隨試驗(yàn)時間延長顯著升高（P＜0.05），以同一取樣時間對照組水體NO2--N 含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明，該菌株添加濃度＞1×105cfu/mL 時具有明顯的劑量依賴降NO2--N 的作用（P＜0.05）。添加劑量5×105cfu/mL 對水體NO2--N 去除率可高出水體自凈能力的75%（圖2）。

表2 不同濃度BS 對水體NO2ˉ-N含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Tab.2 Effect of different concentrations of BS on nitrite content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

圖2 各取樣時間點(diǎn)以對照組為基準(zhǔn)的試驗(yàn)組NO2--N去除率Fig.2 Removal rate of NO2--N at each sampling time compared with the control group

2.3 不同濃度枯草芽孢桿菌對水體COD 含量的影響

由表3 可知，對照組、添加劑量≤5×104cfu/mL組水體COD 含量于第2 d 即顯著降至最低（P＜0.05）。添加劑量≥1×105處理組水體COD 含量則在第2 d 顯著升至最高后又恢復(fù)至初始水平。同一取樣時間點(diǎn)添加劑量≤5×104cfu/mL 組水體中COD 含量無顯著差異（P＞0.05），添加劑量≥1×105cfu/mL 組水體COD 含量呈明顯劑量遞增（P＜0.05）。以同一取樣時間對照組水體COD 含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明：該枯草芽孢桿菌各添加濃度對水體COD 無明顯去除作用（圖3）。

表3 不同濃度BS 對水體COD 含量的處理（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Tab.3 Effect of different concentrations of BS on COD content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

圖3 各取樣時間點(diǎn)以對照組為基準(zhǔn)的試驗(yàn)組COD 去除率Fig.3 Removal rate of COD at each sampling time compared with the control group

3 討論

3.1 不同濃度枯草芽孢桿菌對水體NH4+-N含量的影響

本試驗(yàn)中，各組水體中NH4+-N含量均出現(xiàn)短期升高的現(xiàn)象，推測是水體有機(jī)質(zhì)有氧氧化分解所致[9,10]。同一取樣時間點(diǎn)以對照組NH4+-N含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明：添加劑量（≥2.5×105cfu/mL）時該菌株具有短期劑量依賴效應(yīng)去除水體NH4+-N含量的作用，隨后出現(xiàn)劑量依賴性反彈，推測是添加濃度≥2.5×105cfu/mL 時引起水體生物間競爭性死亡、水體中增加的還原性物質(zhì)向NH4+-N轉(zhuǎn)化所致。本試驗(yàn)中，高濃度添加組（≥2.5×105cfu/mL）水體COD 含量于試驗(yàn)第2 d 顯著升高后下降，水體NH4+-N含量于第3 d 顯著上升也一定程度上說明該菌添加初期導(dǎo)致水體還原性物質(zhì)增多，增多的還原性物質(zhì)向NH4+-N轉(zhuǎn)化，添加枯草芽孢桿菌后水體氨氮先下降后上升的現(xiàn)象，在其他研究中也有報(bào)道[11]?？莶菅挎邨U菌是具有高活性消化酶的需氧異養(yǎng)菌，無淤泥、無投餌等外源性有機(jī)質(zhì)輸入下高劑量添加勢必會引起水體微生物群落間的競爭性改變和水體還原性物質(zhì)增多[11]。張念海[12]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌的添加可競爭性地抑制水體中某些優(yōu)勢藻類的生長。王月霞等[13]也發(fā)現(xiàn)，魚塘水體中色球藻Chroococcus 數(shù)量與芽孢桿菌添加量呈典型負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱藱z測該菌株的短期水質(zhì)凈化能力，故未對長時間下水體微生物間的相互作用及其動態(tài)變化趨勢進(jìn)行研究。

3.2 不同濃度枯草芽孢桿菌對水體NO2ˉ-N含量的影響

水體中NO2--N 能將魚類血紅蛋白中的二價鐵氧化為三價鐵，損害血液的運(yùn)氧能力，引起魚類窒息死亡[14,15]。有效控制水體中NO2--N 含量是決定養(yǎng)殖成敗的重要因素。本試驗(yàn)中，各組水體NO2--N呈上升趨勢，NH4+-N在升至最高后下降，說明該菌株添加初期水體氨氧化引起的亞硝化占主導(dǎo)作用[16]。同一時間下，高劑量添加組（＞1×105cfu/mL）水體中NO2--N 含量呈現(xiàn)明顯劑量遞減效應(yīng)，添加濃度＞1×105cfu/mL 時該菌株對水體NO2--N 的清除效率比對照組高75%，表明一定劑量下該菌株具有明顯的降低NO2--N的作用。

枯草芽孢桿菌對水體NO2--N 的去除效果受菌株投放數(shù)量、菌株定植特性和能力、水體微生物種類與數(shù)量、水體營養(yǎng)物質(zhì)含量、溶氧、溫度等多因素的影響。朱長生等[5]研究發(fā)現(xiàn)，潑灑復(fù)合芽孢桿菌菌劑（水體終濃度為1.5×104cfu/mL）后，短期（1 d）可有效降低水體NO2ˉ-N，7 d 后效果喪失；鄒文娟等[17]在水體中投放終濃度為0.25×105cfu/mL 的枯草芽孢桿菌后，水體中NO2--N含量前期顯著上升，7 d后下降；溫志新等[18]在刺參Apostichopus japoncus養(yǎng)殖水體中發(fā)現(xiàn)，未充氣狀態(tài)下，枯草芽孢桿菌對養(yǎng)殖廢水中的氨氮和亞硝酸鹽無有效去除作用；王月霞等[13]發(fā)現(xiàn)，池塘水體溶氧量上升至6 mg/mL時，所用枯草芽孢桿菌才有明顯去除水體NO2--N的效應(yīng)；湯寶貴等[19]在對蝦養(yǎng)殖池的凈化研究中發(fā)現(xiàn)，添加1.04×105～2.08×105cfu/mL 芽孢桿菌，短時間（≤24 h）內(nèi)可顯著降低水體NO2--N的含量，但隨著時間延長劑量相關(guān)效應(yīng)消失。也有研究發(fā)現(xiàn)，簡單水體中添加過量枯草芽孢桿菌會導(dǎo)致水體負(fù)荷增大，影響水體生態(tài)平衡，不利于發(fā)揮凈水作用[12]，水體氧氣不足或水體添加濃度過高，均會導(dǎo)致菌種密度、水體空間和營養(yǎng)物質(zhì)的制約效應(yīng)，抑制其對水體氨氮和NO2--N的去除作用。本實(shí)驗(yàn)中，該菌株添加量為5×105cfu/mL 時，降NO2--N效果顯著高于湯寶貴等[19]、溫志新等[18]研究中所用菌株，與朱長生等[5]所用復(fù)合芽孢桿菌菌劑效果相當(dāng)。總體而言，本試驗(yàn)所用菌株可作為快速有效降低水體NO2--N含量的目標(biāo)菌株，但尚需與其他有效降低水體NH4+-N 和COD 的產(chǎn)品進(jìn)行配伍，以更好地發(fā)揮凈水作用。

3.3 不同濃度枯草芽孢桿菌對水體COD 含量的影響

本試驗(yàn)中，試驗(yàn)期間對照組水體COD 含量持續(xù)降低，說明水體具有一定的自凈作用，是水體自養(yǎng)型生物同化和異養(yǎng)型生物分解作用的共同體現(xiàn)[20 ]。

同一取樣時間添加濃度≤5×104cfu/mL 組水體COD 含量與對照組無顯著差異，說明低濃度該菌株（≤5×104cfu/mL）下水體自凈作用占主導(dǎo)因素；高劑量（≥1×105cfu/mL）添加時，試驗(yàn)第2 d 水體COD 含量明顯呈劑量依賴上升效應(yīng)，是高濃度添加導(dǎo)致水體還原性物質(zhì)短期快速增多所致。從時間上看，添加劑量≥1×105cfu/mL 組水體中COD 先迅速上升至最高又迅速下降至初始水平，說明該菌株具有一定的COD 清除能力。試驗(yàn)結(jié)束時，BS6 和BS7 組水體COD 含量仍高于同一時間點(diǎn)對照組水體COD 含量，推測應(yīng)是試驗(yàn)周期短所致。添加一定濃度枯草芽孢桿菌時，水體COD 含量先升后降與劉樹彬等[21]評價枯草芽孢桿菌HAINUP40 對養(yǎng)殖廢水中COD 的去除趨勢一致。

3.4 結(jié)論

本試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌菌株添加量為2.5×105～5×105cfu/mL 時，可在短期內(nèi)有效降低養(yǎng)殖水體中NO2－-N 含量，對去除水體NH4+-N含量和COD 也有一定效果，故該菌株可作為有效去除水體NO2－-N的目標(biāo)菌株，但因枯草芽孢桿菌是嚴(yán)格的需氧型異養(yǎng)菌，添加的芽孢桿菌直接參與到水體微生物群落間的相互競爭中，短期內(nèi)易造成水體中還原性物質(zhì)增多，故使用該菌株應(yīng)與其他能有效去除水體NH4+-N和COD 的菌株配合使用。