姚周麟 吳韶輝 林 媚平新亮

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州 318026）

柚皮素（Naringenin，NAR）是一種天然的類黃酮物質(zhì)，屬于二氫黃酮類，是柚皮苷（Naringin）的苷元，主要存在于蕓香科植物如葡萄柚、橙、佛手柑等柑橘類水果中。柚皮素在常溫下為白色針狀結(jié)晶，溶于乙醇、乙醚和苯等有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水。柑橘中的柚皮素主要存在果皮中，如溫州蜜柑和紅美人的果皮中的柚皮素含量達(dá) 4.82、11.36 mg/kg[1]，果肉僅分別為0.09、0.20 mg/kg；李勛蘭等[2]研究了11種柑橘果肉的柚皮素含量也發(fā)現(xiàn)僅有 0.01～0.28 mg/kg。

柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗腫瘤、解痙和利膽、預(yù)防和治療肝病、抑制血小板凝結(jié)、抗粥樣動(dòng)脈硬化等多種藥理活性（圖1）。如柚皮素能減輕抗結(jié)核藥引起的大鼠肝腎損傷[3]；促進(jìn)糖尿病大鼠中二甲雙胍的清除[4]；可作為 T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性炎癥疾病的預(yù)防/治療劑[5]和免疫相關(guān)疾病治療劑中潛在的免疫調(diào)節(jié)劑[6]；可減少I型糖尿病大鼠晶狀體的氧化應(yīng)激標(biāo)志物[7]，用于多種氧化應(yīng)激疾病[8]；能有效抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移[9]；柚皮素納米制劑在預(yù)防和治療癌癥中有潛力[10]，和橙皮素聯(lián)合治療一種胰腺癌而不會(huì)引起對(duì)正常細(xì)胞的毒性[11]等，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。本文綜述了柑橘柚皮素的提取與手性對(duì)映體拆分方法等方面的研究，并對(duì)手性柚皮素的研究方向進(jìn)行了展望，為柑橘中手性類黃酮物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論參考。

圖1 柚皮素抗氧化作用原理

1 柚皮素的提取方法

柚皮素的提取對(duì)分析結(jié)果至關(guān)重要，某種程度上來說，前處理決定了分析測(cè)試的結(jié)果，直接影響分析數(shù)據(jù)的精確性。柑橘中柚皮素等類黃酮成分檢測(cè)的前處理提取方法常用的為溶劑萃取法[12]，利用該組分在兩種互不相溶的試劑中分配系數(shù)的不同，使其從一種溶液轉(zhuǎn)移至另一種溶劑，從而達(dá)到分離和富集的目的，但萃取溶劑通常易揮發(fā)、易燃、用量大，且有毒性；其他方法還有酶解法、超聲波提取法等。

1.1 單一提取法

國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)植物中類黃酮等有效成分的提取方法做了較多的研究。Wu[13]等用深共熔溶劑（Deep-eutectic Solvent，DES）輔助超聲萃?。║ltrasound-assisted extraction，UAE）辣木的總酚和類黃酮含量，提供了一種綠色高效的方法；Molina[14]等用沖擊波輔助提取太子參藥材中酚酸和類黃酮，與常規(guī)溶劑法比，提取效率明顯更高；Mai[15]等通過超聲輔助萃取和溫度誘導(dǎo)濁點(diǎn)提?。═emperatureinduced cloud point extraction，TICPE），開發(fā)了一種從大葉黃楊中同時(shí)提取和富集類黃酮化合物的綠色方法，具有更高的萃取效率和更好的萃取選擇性；Yu[16]等用超聲波輔助提取積雪草中類黃酮，顯著提高了提取率；Song[17]等用超臨界二氧化碳流體萃取新疆棗葉中黃酮類化合物，可得到更高的總類黃酮含量及更強(qiáng)的抗氧化和抗增殖活性。

1.2 酶解提取法

更完全地提取有效成分，必須去掉由果膠質(zhì)、纖維素和半纖維素及木質(zhì)素等構(gòu)成的細(xì)胞壁，而采用生物酶解法是專一高效的催化方法。酶不僅用于細(xì)胞壁降解，還有利于增加目標(biāo)化合物的溶解度，增加提取效率。常用的酶如果膠酶（Polygalacturonase）是一組復(fù)雜的酶，可降解植物組織中存在的各種果膠類物質(zhì)[18]，在水果、造紙和紡織工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用。Chen等用酶解輔助提取銀杏葉中黃酮類化合物，改善了提取效果，提高了提取率[19]；細(xì)胞壁降解酶能改善從小球藻中提取脂質(zhì)的能力[20]；堿預(yù)處理再輔助酶處理，能破壞細(xì)胞壁并從擬微球藻中提取脂質(zhì)[21]；纖維素酶增加了稻草糖化過程中酚酸的釋放[22]；Wilkins等用纖維素酶和果膠酶水解葡萄柚果皮廢料，產(chǎn)生糖，將其用于生產(chǎn)乙醇[23]；Wei等用雙酶輔助鹽漬法提取草種子中的黃酮，可用于大量生產(chǎn)類黃酮[24]。

1.3 超聲波提取法

超聲波獨(dú)具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，使有效成分提取更充分，可直接用于提取目標(biāo)化合物，是一種比較常見的類黃酮提取方法。Qiao等利用超聲波聲化學(xué)作用處理了柑橘中14種類黃酮[25]；Yang[26]等使用結(jié)合熱回流萃?。℉eat Reflux Extraction，HRE）和超聲輔助的聯(lián)用方法（Heat and Ultrasonics-assisted Extraction，HUAE）從半枝蓮中提取類黃酮，明確了該方法的優(yōu)越性。Meng[27]等用超聲輔助深共熔溶劑提取黃酮，除了減少了對(duì)環(huán)境的影響，更提高了提取效率；Belwal[28]等用超聲波輔助大規(guī)模提取梨果皮中花色苷，用于大批量提取和工業(yè)應(yīng)用。

1.4 超聲波輔助酶解提取法

超聲波也是酶催化反應(yīng)的強(qiáng)大工具，可以影響酶和底物的結(jié)合，進(jìn)而改善果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶活性[29]。超聲通過瞬時(shí)空化在介質(zhì)中產(chǎn)生的強(qiáng)對(duì)流而增加了酶促過程中的碰撞次數(shù)，并通過增加酶與有機(jī)分子之間的相互作用來提高降解效率[30]，因此采用超聲波輔助酶解可以有效提高反應(yīng)效率。低頻超聲的振幅，反射器的存在，與角的距離和基板的形狀均可影響纖維素酶水解的效率[31]。通過超聲可增強(qiáng)甘蔗渣的酶解作用，還原糖釋放的增加[32]；Subhedar[33]等利用超聲波輻照輔助酶促水解生產(chǎn)可發(fā)酵糖，進(jìn)一步生產(chǎn)生物乙醇；Lei[34]等酶解-超聲輔助（EUAE）提取甜茶樹中的黃酮類化合物；張[35]等采用超聲波輔助酶法提取桑葚酒殘留物中花色苷，提高了生產(chǎn)效率；Subhedar[36]等利用超聲波強(qiáng)化廢報(bào)紙的酶促水解以生產(chǎn)可發(fā)酵的糖，將木質(zhì)纖維素有效轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖進(jìn)而生產(chǎn)生物乙醇，超聲和酶的組合具有協(xié)同作用，可降低對(duì)酶和底物結(jié)合的擴(kuò)散限制，并提高反應(yīng)速率。

2 手性柚皮素的拆分方法

2.1 外消旋柚皮素的分析方法

關(guān)于類黃酮功能性成分的外消旋檢測(cè)前人已經(jīng)做了較多的研究，較新的檢測(cè)方法包括：HPLC-DAD[37]、UHPLC-QqQ-MS/MS[38]、UPLC-QTOF-MS[39]等。外消旋柚皮素的檢測(cè)方法也有一些研究：UHPLC-QqQ-MS/MS[12]、傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜-紫外檢測(cè)-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜[25]、LC-MS/MS[40]、SM-USA-MSPD-高效液相色譜法聯(lián)用[41]，均能滿足實(shí)驗(yàn)需要。

2.2 手性旋柚皮素的拆分方法

目前，對(duì)于柚皮素功能方面的研究，均以外消旋體進(jìn)行。事實(shí)上，柚皮素為手性化合物，有兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體（圖2），手性對(duì)映體有相同的分子量、熔點(diǎn)、溶解度等，但也存在一些理化性質(zhì)的差異。手性柚皮素與手性物質(zhì)相互作用極有可能產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，特別是許多與生物體密切相關(guān)的生化反應(yīng)均和物質(zhì)的手性相關(guān)聯(lián)。而目前尚未有手性柚皮素單體絕對(duì)構(gòu)型的確認(rèn)及手性單體的功能性研究。這是值得期待的研究領(lǐng)域，特別當(dāng)一種對(duì)映體具有有益的生理活性，而另一種對(duì)映體對(duì)人體有害時(shí)，手性成分研究顯得尤為重要。1960年代的“反應(yīng)?！敝禄录?，就是手性化合物其中一個(gè)構(gòu)型引起的慘劇。

圖2 手性柚皮素的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體

手性柚皮素的儀器拆分方法主要為液相色譜（High performance liquid chromato-graph，HPLC）和液相色譜質(zhì)譜（High performance liquid chromatography-Mass，HPLC-MS）聯(lián)用，目前研究進(jìn)展僅處于對(duì)映體的拆分，尚未確定柚皮素R-和S-的絕對(duì)構(gòu)型，作為一個(gè)完整的檢測(cè)方法，均還有待完善。Gaggeri[42]等采用高效液相色譜分離了幾種果汁柚皮素，最終確認(rèn)在手性柱Chiralpak AD-H用純甲醇（不含酸性或堿性添加劑）洗脫，分離度高，但該方法分離時(shí)間長(zhǎng)，未做絕對(duì)構(gòu)型和方法學(xué)確認(rèn)。Si-Ahmed[43]等使用苯基氨基甲酸酯-丙基-β-環(huán)糊精手性固定相的納米液相色譜分離了柚皮素，該方法只保證了兩個(gè)單體的分離，同樣未做絕對(duì)構(gòu)型和方法學(xué)確認(rèn)；Wang[44]等開發(fā)的高速逆流色譜（Highspeed Countercurrent Chromatography，HSCCC）結(jié)合銅(II)-手性離子液體配合物和羥丙基-環(huán)糊精，重點(diǎn)做了兩個(gè)單體的分離，絕對(duì)構(gòu)型和方法學(xué)均未做確認(rèn)，且分離時(shí)間長(zhǎng)，流動(dòng)相復(fù)雜；Baranowska[45,46]等同時(shí)發(fā)表了兩篇關(guān)于柚皮素手性分離的研究，內(nèi)容比較相似，采用RP-UHPLC-DAD的方法，拆分了對(duì)映體單體。

質(zhì)譜是一種測(cè)量離子質(zhì)荷比（質(zhì)量-電荷比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。也就是說，質(zhì)譜是沒辦法確認(rèn)立體結(jié)構(gòu)，只能確定質(zhì)量，因此，建立完善的手性柚皮素拆分方法具有非常大的必要性和緊迫性。

3 小結(jié)

目前，對(duì)柑橘類黃酮物質(zhì)的研究還集中在外消旋混合物的分析和功能驗(yàn)證，對(duì)手性類黃酮對(duì)映體的單獨(dú)或差異性研究仍鮮有報(bào)道。因此，建議在今后開展以下幾個(gè)方面的研究：一是在以柑橘類果皮、果肉和全果等為材料的手性柚皮素研究過程中，應(yīng)采用綠色、高效的復(fù)合酶和超聲波協(xié)同技術(shù)，綜合考慮溫度、pH等對(duì)柚皮素溶解度和穩(wěn)定性的影響[47]，優(yōu)化最佳的前處理?xiàng)l件，降低目標(biāo)功能性成分的損失，為精準(zhǔn)鑒定評(píng)價(jià)手性柚皮素。二是開展手性柚皮素單體的功能性驗(yàn)證。通過對(duì)柑橘柚皮素進(jìn)行手性單體制備，開展抗氧化能力差異性評(píng)價(jià)。三是通過分子生物學(xué)技術(shù)，開展柑橘類手性柚皮素的基因調(diào)控、代謝組學(xué)等機(jī)理研究，為提高柑橘優(yōu)質(zhì)資源開發(fā)利用提供理論參考。