趙 娟，王志宇，段昌學(xué)，王志俊，劉一飛，趙 敏，韓潔茹，李正莉

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太原 030032；2.陜西省商洛市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 商洛 726000)

腸道菌群種類繁多，菌群計(jì)量及檢測(cè)有較大困難，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已建立了許多診斷方法，如細(xì)菌分離鑒定、凝集試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))試劑盒等，但這些方法均費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且靈敏性均不理想，不適用于常規(guī)的臨床診斷，更不適用于集約化生產(chǎn)中細(xì)菌檢測(cè)的需要。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，以及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，特別是16S rRNA被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定，分子生物學(xué)檢測(cè)方法PCR用于Lactobacillus和Bifidobakterien定量的檢測(cè)具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，但假陽性較多，缺乏準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)限制了PCR在實(shí)際臨床中的應(yīng)用[1]。近年來，F(xiàn)QPCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在微生物的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。本研究建立了快速檢測(cè)Lactobacillus和Bifidobakterien的FQ-PCR方法，不僅保留了PCR的優(yōu)點(diǎn)，而且克服了普通PCR的不足，為動(dòng)物腸道微生態(tài)的測(cè)定建立了一種更為有效的方法[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

微量移液器(Eppenderf公司，10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL型)，PCR儀(QIAGEN，Rotor-Gene Q型)，高速低溫離心機(jī)(Sigma，2-16PK型)，電子天平(METTLER TOLEDO，AL104-IC型)，高速離心機(jī)(Eppendorf，1-14型)，摩爾基因型超純水機(jī)(上海摩勒生物科技有限公司，MO6-063型)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，YXQ-LS-SⅡ型)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海聯(lián)進(jìn)醫(yī)療器械廠，101-2-BS-Ⅱ型)，超低溫冰箱(中科美菱公司)。

1.2 主要試劑和材料

QIAamp DNA Stool Mini Kit購自Qiagen公司；TransStart?Probe qPCR SuperMix購自Qiagen公司；酒精為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.5 mL進(jìn)口薄壁離心管購自Corning公司；0.2 mL進(jìn)口薄壁離心管購自Corning公司；0.2 mL平蓋八排管購自Axygen公司；5 mL有蓋離心管為國(guó)產(chǎn)；1 mL、200 μL、10 μL吸頭均為國(guó)產(chǎn)；一次性使用棉簽、手套、口罩為國(guó)產(chǎn)。試驗(yàn)材料(腹瀉仔豬和健康仔豬的糞便樣本)來源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所豬場(chǎng)及山西省天祿豐種豬場(chǎng)。

2 試驗(yàn)步驟

2.1 設(shè)計(jì)qPCR引物[3]

引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2 采集糞便樣品

2020年9月23日至10月23日，在天氣溫度驟降仔豬腹瀉高發(fā)期或仔豬腹瀉發(fā)病集中期，項(xiàng)目組在太原市小店區(qū)南郊繁峙鎮(zhèn)的宏利豬場(chǎng)、山西省運(yùn)城市夏縣眾旺養(yǎng)殖專業(yè)合作社、夏縣宏偉農(nóng)牧有限公司、夏縣健源養(yǎng)殖專業(yè)合作社、夏縣嘉博養(yǎng)殖有限公司等多地采取典型病例糞便作為試驗(yàn)樣本。用棉簽將健康仔豬和腹瀉仔豬糞便采集入已消毒的5 mL離心管內(nèi)，封蓋。每份樣品貼標(biāo)簽，詳細(xì)注明日期、組織來源、編號(hào)。注意樣品一定為新鮮糞便。采集到的樣本帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。分3批次采集樣本，每批次采集健康仔豬糞便和腹瀉仔豬糞便各20份。

2.3 糞便中總DNA提取

1)稱取180～220 mg糞便加入預(yù)冷的2 mL離心管中；2)每管加入1.4 mL的緩沖液ALS(試劑)，渦旋使其完全混勻；3)370 ℃孵育5 min，使其完全裂解；4)渦旋混勻15 s，14 000 r/min離心1 min；5)取1.2 mL的上清液至新的2 mL離心管中，棄沉淀；6)每管加入一片InhibitEX Tablet，立即渦旋直至完全混勻，室溫孵育1 min；7)14 000 r/min離心3 min；8)取全部上清液至新的1.5 mL離心管中，棄沉淀，14 000 r/min離心3 min；9)取新的1.5 mL離心管，每管提前加入15 μL蛋白酶K；10)從第8步中移200 μL上清液至新的1.5 mL離心(已加蛋白酶K)管中；11)加入200 μL的緩沖液，渦旋混勻15 s；12)70 ℃孵育10 min；13)加入200 μL的無水乙醇，完全混勻；14)將全部的上清加入QIAamp spin column柱中，14 000 r/min離心1 min，棄收集管廢液，將柱子重新放入新的收集管中；15)加入500 μL的AW1緩沖液，14 000 r/min離心1 min，將柱子移至新的2 mL收集管中；16)加入500 μL的AW2緩沖液，14 000 r/min離心3 min，棄收集管廢液，將柱子重新放入新的收集管中；17)將柱子放入新的1.5 mL離心管中，14 000 r/min離心1 min；18)將柱子放入新的1.5 mL離心管中，加入200 μL的緩沖液AE，14 000 r/min離心1 min；19)將提取好的DNA做標(biāo)記，-80 ℃長(zhǎng)期保存。

2.4 熒光定量PCR

2.4.1 將DNA從-20 ℃冰箱拿出后置于冰上解凍。

2.4.2 按照以下反應(yīng)體系配置反應(yīng)體系于平蓋八排管中(表2)。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

2.4.3 將八排管的管蓋輕輕蓋到八排管上；將八排管放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)并設(shè)置參數(shù)，PCR反應(yīng)程序如下(表3)。

表3 熒光定量PCR反應(yīng)程序

2.4.4 待PCR結(jié)束后，按照Ct值計(jì)算檢測(cè)基因的表達(dá)情況[4]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

(1)糞便中所提取全DNA濃度及純度見表4。

表4 第1～3批次樣本中提取的全DNA濃度及純度

(2)CT值大，說明拷貝數(shù)小，樣本本身mRNA的數(shù)量少。從圖1、圖2中可以看出，健康組和腹瀉組相比，腹瀉組的CT值大，說明其樣本本身所含的mRNA的量少，即：相對(duì)比健康仔豬來說，腹瀉仔豬中乳酸桿菌和雙歧桿菌的mRNA的量都少。說明因?yàn)楦篂a，仔豬腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量減少，腹瀉影響了仔豬腸道環(huán)境微生態(tài)的平衡和健康[5]。

圖1 樣本中雙歧桿菌擴(kuò)增CT值示意圖

圖2 樣本中乳酸桿菌擴(kuò)增CT值示意圖

(3)斷奶仔豬腹瀉的原發(fā)性因素主要是由于斷奶應(yīng)激引起機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，腸道微生物區(qū)系平衡遭到破壞，造成治病菌大腸桿菌的增殖，益生菌減少，從而導(dǎo)致更為嚴(yán)重的腹瀉，所以補(bǔ)充益生菌能夠有效防治仔豬腹瀉的發(fā)生，為獸醫(yī)臨床防治斷奶仔豬腹瀉提供理論依據(jù)[6]。