楊凱歌, 王薇薇, 王 彥, 閻 超

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200240)

外泌體(exosomes)是一種直徑范圍在50～200 nm且具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡。由各種類型細(xì)胞在正?；蚍钦Ｉ砬闆r下釋放至細(xì)胞外,并存在于血液、尿液、組織液和腦脊液等體液中[1-3]。外泌體攜帶多種生物活性物質(zhì),如核酸、蛋白質(zhì)和小分子代謝物等,并且能夠通過外泌體把這些生物活性物質(zhì)由母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞,以此在各種正常和非正常生理狀態(tài)下傳遞細(xì)胞間信息,即通過傳遞遺傳物質(zhì)、轉(zhuǎn)移受體、信號(hào)分子等方式影響其他細(xì)胞[4,5]。因此,外泌體在細(xì)胞間通訊[6,7]、免疫應(yīng)答[8-10]、代謝途徑[11-13]和腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[7,8,14]等過程中都發(fā)揮著重要的作用。目前,基于外泌體廣泛的生物學(xué)作用,將外泌體用于疾病的診斷和治療的研究與應(yīng)用越來越多[15],如發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物[16-18]和用作藥物傳遞載體[17,19]等。

膽管癌(cholangiocarcinoma, CCA)是一種膽道上皮惡性腫瘤,表現(xiàn)出膽管細(xì)胞分化的特征,占所有原發(fā)性肝癌類型的10%～15%,是第二大常見的原發(fā)性肝癌。CCA在解剖學(xué)上可分為肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)、肝門周圍膽管癌(perihilar cholangiocarcinoma, pCCA)和遠(yuǎn)端膽管癌(distal cholangiocarcinoma, dCCA)[20]。由于大多數(shù)CCA患者早期沒有明顯癥狀,被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期,治愈性手術(shù)僅在10%～15%的病例中可行,且手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)率超過60%。因此,CCA總體疾病預(yù)后較差,所有患者的5年生存率僅為5%～15%[21]。當(dāng)前CCA的診斷主要依靠影像技術(shù),包括超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)以及先進(jìn)的內(nèi)鏡膽道成像技術(shù)[22]。但是CCA腫瘤類似物(膿腫、血管瘤和融合性肝纖維化等)會(huì)對(duì)影像診斷造成較大的影響[23]。CCA最常用的血清診斷標(biāo)志物是碳水化合物抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA),同時(shí)也是術(shù)后監(jiān)測(cè)的有力工具。但是,CA 19-9和CEA的靈敏度及特異性都較低[22,24,25]。因此,急需發(fā)展新的特異性生物標(biāo)志物用于CCA的篩查和早期診斷,促進(jìn)CCA的治療。

血清和外泌體中都含有豐富的蛋白質(zhì),是良好的基于蛋白質(zhì)組學(xué)的潛在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)樣本之一[26]。因此,本文選擇正常志愿者和CCA亞型中的iCCA患者的血清樣本,從中提取外泌體并進(jìn)行表征驗(yàn)證;然后基于液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)的無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)兩組樣本的血清和血清來源外泌體分別進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)處理,篩選出疾病狀態(tài)下差異表達(dá)的蛋白質(zhì),從蛋白質(zhì)水平理解iCCA腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程,為iCCA的早期診斷和潛在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供參考和借鑒。此外,比較血清和血清來源外泌體這兩類樣本獲得的蛋白質(zhì)組信息,探究不同類型的樣本在組學(xué)分析中的差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 血清樣本的收集

本研究中所用健康志愿者對(duì)照組(HC)及iCCA患者血清樣本均由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽醫(yī)院提供。所有采集的HC和iCCA患者臨床樣本均與提供者簽署了書面知情同意書,并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)共采集了6例HC血清樣本和6例iCCA患者血清樣本。采集的外周血樣本在室溫下靜置1 h,然后以2 000g離心10 min,取上清液血清置于-80 ℃下保存直至使用。

1.2 儀器、試劑與材料

nLC1200-Q Exactive Plus納升液相色譜-四極桿軌道阱質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國(guó));ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀(NTA, Particle Metrix,德國(guó));JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM, JEOL,日本); Centrifuge 5417R冷凍離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó));電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、Tanon 1600全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)和Tanon 4600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)(Tanon,中國(guó)); FiveEasyTMpH計(jì)(Mettler Toledo,瑞士)。

Umibio外泌體提取純化試劑盒(Cat. No: UR52136, Umibio,中國(guó)); Radio Immunoprecipitation Assay (RIPA)裂解液、100 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、考馬斯亮藍(lán)G250、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)蛋白上樣緩沖液(5×)、30%Acr-Bis(29∶1)制膠液、1.5 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.8)、1 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)、四甲基乙二胺(TEMED)、BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(10～170 kD)、吐溫-20(Tween-20)、CD9 兔單克隆抗體、CD63兔單克隆抗體、CD81兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司;磷鎢酸負(fù)染色液(2%)購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司;分析純丙酮、甲醇、乙醇、甲酸、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲酸購(gòu)自Thermofisher Scientific(美國(guó)); LC-MS級(jí)碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(≥98%)、碘乙酰胺(98%)購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó));測(cè)序級(jí)修飾胰蛋白酶購(gòu)自Promega Corporation(美國(guó))。

聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merck，Germany); 0.22 μm親水針式濾器(Anpel,中國(guó)); 10 kDa超濾管(Sartorius,德國(guó)); C18脫鹽柱(GL Science,日本)。

1.3 血清外泌體的分離

血清預(yù)處理:將-80 ℃凍存的血清樣本解凍后通過0.22 μm濾膜過濾。過濾后的血清樣本于4 ℃以3 000g離心10 min,去除樣本中的細(xì)胞碎片;將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,于4 ℃以10 000g離心10 min,進(jìn)一步去除樣本中的雜質(zhì)和較大的細(xì)胞外囊泡,取上清液。然后將經(jīng)過預(yù)處理的血清樣本分為兩份,一份用于外泌體提取,一份用于血清蛋白質(zhì)組樣本提取。

外泌體分離:將一份經(jīng)過預(yù)處理的血清樣本按照血清樣本、磷酸鹽緩沖液(PBS,配制方法:8 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、1.44 g磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鉀、1 L純水,鹽酸調(diào)pH至7.4)、Blood PureExo Solution(體積比為1∶3∶1)混合,渦旋振蕩混勻1 min后置于4 ℃靜置2 h。靜置后將上述混合液于4 ℃以10 000g離心60 min,棄去上清液,并取適量PBS重懸沉淀,并將重懸液于4 ℃以12 000g離心2 min,取上清液,重復(fù)2～3次,獲得的上清液為外泌體粗制劑。將收獲的外泌體粗制劑轉(zhuǎn)移入Exosome Purification Filter柱上室中,于4 ℃以3 000g離心10 min,離心后收集柱管底液體,即為純化后的外泌體溶液,將其置于-80 ℃下保存直至使用。

取部分分離得到的血清外泌體,加入相同體積的RIPA裂解液和1%(體積分?jǐn)?shù))的100 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑,混勻后置于冰上裂解60 min,于4 ℃以10 000g離心5 min后取上清液,即為外泌體蛋白質(zhì)溶液。

1.4 外泌體的表征

1.4.1納米粒徑分析

通過NTA分析外泌體的粒徑分布范圍。首先在樣品池中注入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(粒徑為100 nm)校準(zhǔn)儀器;用PBS沖洗樣品池后,將經(jīng)PBS適當(dāng)稀釋的外泌體樣品注入樣品池以測(cè)量粒徑,結(jié)果以每mL溶液顆粒數(shù)累積值為縱坐標(biāo),粒徑值(單位為nm)為橫坐標(biāo),即particles/mL (sum)-diameter (nm)的形式顯示。

1.4.2蛋白質(zhì)免疫印跡分析

采用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)血清外泌體的標(biāo)志性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),并用僅經(jīng)預(yù)處理的血清樣品作為對(duì)照。簡(jiǎn)要步驟如下:HC組和iCCA組的血清及血清外泌體蛋白質(zhì)溶液通過BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,分別各取10 μg蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合并在100 ℃煮沸后,上樣到10% SDS-PAGE凝膠中,先在90 V電壓下電泳30 min,然后在120 V電壓下電泳約60 min。將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到預(yù)先用甲醇活化好的PVDF膜上(濕轉(zhuǎn)法,恒流200 mA, 90 min)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜,用TBST(Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液,配制方法:3 g Tris, 8.8 g氯化鈉,1 L純水,1 mL Tween-20)配制的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA在室溫、50 r/min下封閉1 h,封閉后將PVDF膜分別與CD9、CD63和CD81抗體在4 ℃下共孵育過夜。將一抗孵育過夜后的PVDF膜用TBST溶液洗滌3次,加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗,在室溫、50 r/min下孵育2 h。二抗孵育后的PVDF膜用TBST洗滌3次后,加入顯影液并通過自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像。

1.4.3透射電鏡分析

將10 μL血清外泌體溶液滴加在200目高聚碳膜銅網(wǎng)上,并靜置10 min以充分吸附。用濾紙吸去多余的液體,滴加10 μL 2%磷鎢酸進(jìn)行2～3 min的負(fù)染色。用濾紙吸去多余的液體,在室溫下干燥后通過TEM進(jìn)行形貌觀察。

1.5 基于考馬斯亮藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠電泳

分別取HC和iCCA的血清樣品和血清外泌體蛋白質(zhì)溶液樣品中10 μg蛋白質(zhì),并分別與上樣緩沖液混合后在100 ℃煮沸,上樣到10% SDS-PAGE凝膠中,先在90 V電壓下電泳30 min,然后在120 V電壓下電泳約60 min。電泳結(jié)束后,將SDS-PAGE凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色并脫色后,拍攝圖像。

1.6 蛋白質(zhì)組樣品處理

分別取每個(gè)HC和iCCA的血清樣品和血清外泌體蛋白質(zhì)溶液樣品中50 μg蛋白質(zhì),加入6倍體積的蛋白沉淀劑(乙醇-丙酮-甲酸,50∶50∶0.1,v/v/v),在-20 ℃下過夜。過夜后溶液于4 ℃以10 000g離心60 min,棄去上清液,沉淀用90%(v/v)丙酮水溶液清洗2遍,于室溫晾干10 min,將沉淀溶解于200 μL 100 mmol/L碳酸氫銨水溶液中。然后在蛋白質(zhì)溶液中加入2 μL 1 mol/L二硫蘇糖醇溶液,于37 ℃孵育還原1 h;加入10 μL 1 mol/L碘乙酰胺溶液,于室溫避光烷基化40 min。將上述液體轉(zhuǎn)移至10 kDa超濾管中,于4 ℃以10 000g離心20 min,棄去濾液,加入50 mmol/L碳酸氫銨,于4 ℃以10 000g離心20 min,棄去濾液,重復(fù)3次,然后按酶和蛋白1∶25(質(zhì)量比)加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解過夜。酶解后,于4 ℃以10 000g離心20 min,收集濾液。上述濾液經(jīng)C18脫鹽柱脫鹽后干燥,用10 μL 0.1%甲酸水溶液復(fù)溶多肽后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.7 基于LC-MS的蛋白質(zhì)組分析

多肽樣品通過配備有電噴霧電離(ESI)納米噴霧源的nLC1200-Q Exactive Plus儀的自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入C18柱中(50 cm×75 μm, 3 μm)。流動(dòng)相A相是0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B相是0.1%甲酸-80%乙腈-20%水溶液。總流速是300 nL/min,梯度如下:0～2 min, 2%B～6%B; 2～95 min, 6%B～20%B; 95～107 min, 20%B～32%B; 107～108 min, 32%B～100%B; 108～110 min, 100%B。掃描模式是正模式,離子源噴霧電壓設(shè)置為1.8 kV,毛細(xì)管溫度設(shè)置為275 ℃。質(zhì)譜一級(jí)掃描質(zhì)量數(shù)范圍為m/z350～1 800,分辨率為70 000;自動(dòng)增益目標(biāo)值(AGC)為3×106,最大離子注入時(shí)間(MIT)為50 ms。二級(jí)掃描(dd-MS2/dd-SIM)的分辨率為17 500, AGC為1×105, MIT為45 ms。選取豐度前20的肽段進(jìn)行二級(jí)裂解,碎裂模式為高能碰撞解離(HCD),碰撞能(NCE)設(shè)置為28,離子排除是排除電荷為1、7、8和大于8的離子,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為30 s。使用軟件Proteome Discoverer 2.5(ThermoFisher Scientific)對(duì)原始LC-MS/MS數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析,并根據(jù)Uniprot人類數(shù)據(jù)庫(kù)搜索譜圖(sequence 20148, https://www.uniprot.org/)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索參數(shù)設(shè)置為固定修飾為氨基甲酰甲基(C),可變修飾為氧化(M)、脫酰胺(N, Q)和乙?；?N-末端);初始前體離子和碎片離子的質(zhì)量容差分別為1×10-5Da和0.02 Da。最多允許2個(gè)胰蛋白酶漏切位點(diǎn)。肽鑒定的過濾設(shè)置為至少檢測(cè)到2個(gè)特征肽段且假陽(yáng)率(FDR)小于1%。

1.8 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析

對(duì)HC和iCCA的血清樣品中鑒定到的蛋白質(zhì)以及HC和iCCA的血清外泌體樣品中鑒定到的蛋白質(zhì)分別進(jìn)行相對(duì)定量比較。對(duì)于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的原始數(shù)據(jù),保留HC和iCCA組中表達(dá)率均≥50%的蛋白質(zhì)的表達(dá)值(或一組表達(dá)率為0,另一組表達(dá)率≥50%),并用同組樣品的平均值填充缺失值,獲得可信蛋白表達(dá)值。對(duì)可信蛋白表達(dá)值進(jìn)行中位數(shù)歸一化和log2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,獲得可信蛋白質(zhì)表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù),并用可信蛋白表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化前后數(shù)據(jù)(可信蛋白標(biāo)準(zhǔn)化前的表達(dá)值以log2intensity形式展示)繪制箱線圖。并根據(jù)可信蛋白質(zhì)表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析,通過無監(jiān)督的主成分分析(PCA)和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)觀察基于血清或血清外泌體的無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組能否區(qū)分HC和iCCA。

對(duì)可信蛋白表達(dá)值的中位數(shù)歸一化數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8軟件通過moderate t-statistic計(jì)算P值,并基于P值<0.05和差異倍數(shù)(fold change, FC)值<0.5 (下調(diào))或>2 (上調(diào))篩選出HC和iCCA組之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過韋恩圖比較鑒定到的血清外泌體蛋白質(zhì)和ExoCarta外泌體蛋白質(zhì)庫(kù)(http://www.exocarta.org);比較基于血清外泌體樣品篩選得到的iCCA組相對(duì)HC組的差異蛋白質(zhì)和ExoCarta外泌體蛋白質(zhì)庫(kù);比較基于血清樣品和基于血清外泌體樣品篩選得到的iCCA組相對(duì)HC組的差異蛋白質(zhì)。最后,基于免費(fèi)的在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息,包括基因本體論(GO)富集分析(根據(jù)-log10FDR排序,展示每個(gè)類別的top10, https://string-db.org/)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析(根據(jù)-log10P-value排序,展示top15; http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/),并根據(jù)獲得的生物學(xué)信息,使用GraphPad Prism 8和Origin 2019b軟件繪制條形圖和氣泡圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 血清外泌體的表征

為了驗(yàn)證通過外泌體提取純化試劑盒能夠從血清中成功提取獲得外泌體,對(duì)分離提取的血清外泌體分別進(jìn)行納米粒徑分布分析、標(biāo)志性蛋白免疫印跡分析和透射電鏡分析,結(jié)果見圖1。從圖1a和1b的外泌體粒徑分布結(jié)果可知,HC血清中提取的外泌體粒徑的X10、X50和X90(顆粒從小到大排列,分別包含前10%、50%和90%顆粒數(shù)時(shí)的粒徑值)分別為78.4、141.9和221.0 nm,峰值在164.9 nm; iCCA血清中提取的外泌體粒徑的X10、X50和X90分別為80.8、146.4和238.4 nm,峰值在171.0 nm,基本都符合定義中外泌體的粒徑分布范圍[1,2]。

圖 1 血清外泌體的表征Fig. 1 Characterization of serum exosomes a. size range of healthy control (HC) serum exosomes measured using nanoparticle tracking analysis (NTA). b. size range of intrahepatic cholangiocarcinoma (iCCA) serum exosomes measured using NTA. c. Western blotting analysis of CD81, CD63 and CD9 in the serum exosomes and serum (HC and iCCA). d. TEM image of HC serum exosomes. e. TEM image of iCCA serum exosomes. White arrow: vesicle.

然后,采用蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證分離提取的血清外泌體樣品中外泌體標(biāo)志性蛋白CD9、CD63和CD81的存在,同時(shí)以僅經(jīng)預(yù)處理的血清樣品作為對(duì)照,如圖1c所示,在從HC和iCCA血清提取的外泌體樣品中(圖1c中HC Exo和iCCA Exo泳道),都能夠檢測(cè)到標(biāo)志性蛋白CD9、CD63和CD81的存在;而對(duì)于HC和iCCA的血清樣品(圖1c中HC Serum和iCCA Serum泳道),僅能觀察到微弱的條帶甚至沒有條帶,表明盡管血清中存在外泌體,但是由于外泌體的濃度較低,因此無法通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到外泌體標(biāo)志性蛋白。同時(shí),外泌體樣品中標(biāo)志性蛋白質(zhì)的高含量也進(jìn)一步證明了血清中的外泌體獲得了富集和分離。

最后,對(duì)HC和iCCA血清中提取的外泌體樣品進(jìn)行了TEM分析,如圖1d和1e所示,能夠觀察到直徑在100 nm左右且具有經(jīng)典的茶托樣結(jié)構(gòu)的囊泡(圖1d和1e中箭頭所指),符合外泌體的形貌特征[1,27]。但是,同樣能夠觀察到許多不具備外泌體經(jīng)典結(jié)構(gòu)的圓形物質(zhì)(直徑范圍在50～200 nm左右),這些物質(zhì)可能是由于過度負(fù)染色而無法在透射電鏡下呈現(xiàn)出經(jīng)典結(jié)構(gòu)的外泌體,也可能是一些與外泌體共分離的雜質(zhì),如與外泌體粒徑范圍有重疊的極低密度脂蛋白(VLDL, 30～80 nm, 0.930～1.006 g/cm3)和乳糜微粒(CM, 75～1 200 nm, <0.930 g/cm3)等[28]。我們知道,獲取純凈的外泌體目前還非常困難[29],所以盡管該外泌體分離方法會(huì)引入一些雜質(zhì),但是納米粒徑分布分析、標(biāo)志性蛋白免疫印跡分析和透射電鏡分析的結(jié)果都表明血清外泌體得到了較好的富集分離,所獲得的血清外泌體可以用于后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[30]。

2.2 血清外泌體的分離效果評(píng)價(jià)

首先采用SDS-PAGE對(duì)提取的外泌體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步的分析,同時(shí)以血清蛋白質(zhì)作為對(duì)照,結(jié)果如圖2a所示。從SDS-PAGE圖像中可以觀察到,血清外泌體的蛋白質(zhì)輪廓與血清蛋白質(zhì)有較大的區(qū)別,特別是一些血清中高豐度的蛋白質(zhì)在外泌體中有明顯的減少或者消失,如66 kDa的白蛋白(albumin)。但是,血清和血清外泌體泳道上的條帶也有一些相似點(diǎn),即一些雜質(zhì)如免疫球蛋白未能有效除去,因此在外泌體中也可以觀察到免疫球蛋白IgG的重鏈(約50 kDa)和輕鏈(約25 kDa)的條帶(可能是由于免疫球蛋白與外泌體膜表面的蛋白質(zhì)等分子發(fā)生相互作用而導(dǎo)致的共分離[31])。此外,外泌體中出現(xiàn)了一些血清中沒有的蛋白質(zhì)條帶,這些可能來源于外泌體內(nèi)含的蛋白質(zhì)相對(duì)含量的提高,這有利于后續(xù)的質(zhì)譜分析。

圖 2 血清外泌體的蛋白質(zhì)組分析Fig. 2 Proteome analysis of serum exosomes a. SDS-PAGE analysis of proteins of the serum exosomes and serum (HC and iCCA). b. Venn diagram of the identified proteins of the serum exosomes by LC-MS and ExoCarta database.

進(jìn)一步利用LC-MS對(duì)外泌體中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析,在12個(gè)外泌體樣品中共鑒定到了547種蛋白質(zhì),其中有341種蛋白質(zhì)歸屬于外泌體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)ExoCarta,如圖2b所示。超過60%的鑒定蛋白質(zhì)歸屬于外泌體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)也進(jìn)一步證明了外泌體的成功富集以及在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 血清蛋白質(zhì)組和血清外泌體蛋白質(zhì)組在肝內(nèi)膽管癌中的應(yīng)用

通過LC-MS對(duì)HC與iCCA組的血清和血清外泌體的蛋白質(zhì)組分別進(jìn)行無標(biāo)記定量分析,并將其應(yīng)用于iCCA的診斷、潛在標(biāo)志物篩選和生物信息分析,同時(shí)比較血清和血清外泌體兩種類型的樣本在基于蛋白質(zhì)組的iCCA研究中的差異。

血清和血清外泌體中分別鑒定到317和547種蛋白質(zhì),經(jīng)過篩選后分別獲得271和430種可信蛋白質(zhì)。對(duì)可信蛋白質(zhì)的定量表達(dá)值數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,并通過箱線圖展示標(biāo)準(zhǔn)化前后的數(shù)據(jù),如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)(圖3b)較標(biāo)準(zhǔn)化前數(shù)據(jù)(圖3a)趨于中心位置,表明標(biāo)準(zhǔn)化處理可減少?gòu)?qiáng)度分布之間的差異并確保樣品之間的可比性,使得標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)有著更好的質(zhì)量,更加有利于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖 3 可信蛋白質(zhì)定量表達(dá)值數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理(a)前、(b)后的箱線圖Fig. 3 Boxplots of quantitative expression data of credible proteins (a) before and (b)after normalizationIQR: interquartile range.

利用標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)定量表達(dá)值數(shù)據(jù)對(duì)HC與iCCA組進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析,血清和血清外泌體樣本的PCA得分圖(見圖4a、4b)和OPLS-DA得分圖(見圖4c、4d)都顯示出HC與iCCA組能夠得到良好的區(qū)分。同時(shí),由OPLS-DA模型參數(shù)(見表1)可知,R2Y(cum)和Q2(cum)均大于0.9,表明兩種類型樣本的OPLS-DA模型擬合的良好性。也說明本方法提取的血清外泌體的定量蛋白質(zhì)組能夠較好地區(qū)分HC與iCCA組以及預(yù)測(cè)未知樣本的歸屬,在iCCA診斷應(yīng)用中擁有潛在優(yōu)勢(shì)。

圖 4 基于標(biāo)準(zhǔn)化定量蛋白質(zhì)組的多維統(tǒng)計(jì)分析Fig. 4 Multidimensional statistical analysis based on the normalized quantitative proteome a. principal components analysis (PCA) based on the normalized quantitative proteome of HC and iCCA serum; R2X[1]=0.24, R2X[2]=0.17. b. PCA based on the normalized quantitative proteome of HC and iCCA serum exosomes; R2X[1]=0.26, R2X[2]=0.17. c. orthogonal partial least-squares discrimination analysis (OPLS-DA) based on the normalized quantitative proteome of HC and iCCA serum; R2X[1]=0.40, R2Xo[1]=0.11. d. OPLS-DA based on the normalized quantitative proteome of HC and iCCA serum exosomes; R2X[1]=0.45, R2Xo[1]=0.10. Ellipse: Hotelling’s T2 (95%).

表 1 基于血清和血清外泌體標(biāo)準(zhǔn)化定量蛋白質(zhì)組的OPLS-DA模型參數(shù)

分別從血清和血清外泌體兩組樣本中篩選HC與iCCA組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。根據(jù)FC值和P值兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)篩選,在血清樣本中(見圖5a), iCCA組相對(duì)于HC組有15個(gè)上調(diào)和8個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)(見表2);在血清外泌體樣本中(見圖5b), iCCA組相對(duì)于HC組有33個(gè)上調(diào)和18個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)(見表2),并且在基于血清外泌體篩選到的51個(gè)差異蛋白質(zhì)中,有35個(gè)蛋白質(zhì)歸屬于外泌體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(見圖5c)。同時(shí),基于血清外泌體篩選到的51個(gè)差異蛋白質(zhì)中,IGHA2、IGHG4和PIGR等蛋白質(zhì)(都?xì)w屬于外泌體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù))也已被相關(guān)文獻(xiàn)[32]報(bào)道在健康志愿者和CCA患者的細(xì)胞外囊泡(基于超速離心法從血清中分離)中差異表達(dá),受試者工作特征曲線(ROC曲線)的曲線下面積(AUC)分別為0.824、0.818和0.844,作為生物標(biāo)志物能夠表現(xiàn)出良好的診斷能力。

圖 5 基于血清和血清外泌體樣本的HC與iCCA組的差異蛋白質(zhì)篩選Fig. 5 Screening of differential proteins between HC and iCCA groups based on the serum and serum exosome samples a. volcano plots of identified proteins in the HC and iCCA groups, based on the serum samples. b. volcano plots of identified proteins in the HC and iCCA groups based on the serum exosome samples. c. Venn diagram of the differential proteins screened between HC and iCCA groups based on the serum exosome samples and ExoCarta database. d. Venn diagram of the differential proteins screened between HC and iCCA groups based on the serum and serum exosome samples.

表 2 基于血清和血清外泌體樣本的HC與iCCA組的差異蛋白質(zhì)

此外,基于血清篩選到的23個(gè)差異蛋白質(zhì)和基于血清外泌體篩選到的51個(gè)差異蛋白質(zhì)中,僅有4個(gè)蛋白質(zhì)是重復(fù)的(見圖5d),表明了每種樣本在潛在標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)過程中的獨(dú)特性。同時(shí),基于血清外泌體篩選獲得的差異蛋白質(zhì)數(shù)目多于血清,說明外泌體作為一種新的潛在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的樣本模式,有可能獲得更多的生物學(xué)信息,對(duì)解釋疾病機(jī)制更具備參考價(jià)值。

最后,對(duì)篩選獲得的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息分析,包括GO分析和KEGG通路分析,如圖6所示。這些蛋白質(zhì)富集到的分子功能、生物過程和信號(hào)通路主要涉及天然免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和凝血等,如基于兩種類型樣本差異蛋白質(zhì)富集到的共同生物過程——血小板脫粒(platelet degranulation);基于血清樣本差異蛋白質(zhì)獨(dú)特富集到的NF-κB信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway);以及基于血清外泌體樣本差異蛋白質(zhì)獨(dú)特富集到的中性粒細(xì)胞脫粒(neutrophil degranulation)生物過程及補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)(complement and coagulation cascades)信號(hào)通路。

在腫瘤微環(huán)境中,血小板脫粒過程能增強(qiáng)血小板活化和聚集形成的能力,促使癌栓形成,幫助腫瘤細(xì)胞逃脫免疫攻擊及其轉(zhuǎn)移行為;同時(shí),血小板釋放的顆粒中的促血管生成因子還可促進(jìn)腫瘤血管的生成,為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供生存環(huán)境[33,34]。

NF-κB信號(hào)通路在癌癥中具有雙重作用,激活NF-κB信號(hào)通路一方面可以通過提高細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的活性以靶向消除轉(zhuǎn)化的細(xì)胞等方式發(fā)揮免疫防御作用;另一方面則能夠在多種類型的癌癥中通過控制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體上調(diào)控制腫瘤血管形成等過程以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[35]。如在iCCA中,NF-κB信號(hào)通路的活化能夠上調(diào)CyclinD1等周期促進(jìn)蛋白活化或抑制Caspase-3和Caspase-8蛋白的活化從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[36]。

中性粒細(xì)胞的功能高度依賴于其細(xì)胞質(zhì)顆粒的組成,這些顆粒在中性粒細(xì)胞活化后能夠釋放至細(xì)胞外,即中性粒細(xì)胞脫粒過程,而顆粒中的許多活性物質(zhì)已被研究證明與腫瘤的發(fā)展有關(guān),如中性粒細(xì)胞中預(yù)先儲(chǔ)存的MMP-9能夠通過脫顆粒作用釋放至腫瘤微環(huán)境中從而高度誘導(dǎo)血管生成,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[37]。

補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)通路在免疫反應(yīng)和凝血過程中起著重要作用。同時(shí),補(bǔ)體系統(tǒng)的激活也會(huì)增強(qiáng)腫瘤的惡性生物學(xué)行為,如促腫瘤炎癥、C3AR介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、C7和C1Q介導(dǎo)的腫瘤組織沉積以及C1Q介導(dǎo)的血管形成等。此外,腫瘤細(xì)胞可以通過SERPINE1和MET癌基因的表達(dá)與凝血系統(tǒng)相互作用,并導(dǎo)致SERPINE1顯著上調(diào),而SERPINE1則可以通過Fas/Fas-L、Caspase-3和PI3K/AKT等途徑引起腫瘤的耐藥性[38]。上述結(jié)果表明,在iCCA患者中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)與iCCA患者的腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān),因此差異蛋白質(zhì)富集到的生物過程和信號(hào)通路對(duì)探究疾病的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療方法能夠起到借鑒作用。

此外,由圖6可知,在研究的兩種類型樣本中,由于基于血清樣本篩選出的差異蛋白質(zhì)數(shù)量較少,因此富集到的生物過程、分子功能和細(xì)胞成分的信息也較少(不足10條,已列出獲得的所有條目),且信號(hào)通路與癌癥的相關(guān)性也較基于血清外泌體差異蛋白質(zhì)富集的信號(hào)通路與癌癥的相關(guān)性略低。這是因?yàn)橥饷隗w在形成過程中,通過兩次質(zhì)膜內(nèi)陷以及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、反高爾基網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)產(chǎn)生的早期分選內(nèi)體融合等過程與細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換,從而攜帶母細(xì)胞信息,并通過胞吐過程釋放至胞外。在癌癥進(jìn)展過程中,腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可通過其內(nèi)容物質(zhì)影響腫瘤形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及對(duì)治療的抗性等,如乳腺癌細(xì)胞源性外泌體內(nèi)含的miR-105可通過抑制ZO-1表達(dá)而損害血管完整性和增強(qiáng)血管通透性導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[1]。因此,相比于無關(guān)信息較多的血清樣本(當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量一致時(shí)),分析特異性更強(qiáng)的外泌體樣本內(nèi)含的生物活性物質(zhì)組成(核酸、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物等)可以直觀地反映出機(jī)體和疾病的不同狀態(tài),獲取與疾病相關(guān)性更嘉的生物學(xué)信息,能更有力地解釋疾病的發(fā)病機(jī)制等過程,進(jìn)一步表明了基于外泌體診斷的特異性和敏感性以及外泌體作為組學(xué)分析樣本時(shí)的優(yōu)越性,證明了外泌體的應(yīng)用價(jià)值。

圖 6 基于血清和血清外泌體樣本的HC與iCCA組間差異蛋白質(zhì)的生物信息分析Fig. 6 Biological information analysis of differential proteins between the HC and iCCA groups based on the serum and serum exosomes samples a. Gene Ontology (GO) analysis of differential proteins based on the serum samples; b. GO analysis of differential proteins based on the serum exosome samples; c. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways of differential proteins based on the serum samples; d. KEGG pathways of differential proteins based on the serum exosome samples.

3 結(jié)論

本文通過從血清中分離外泌體并對(duì)其進(jìn)行表征,分別對(duì)血清和血清外泌體的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析,并將其應(yīng)用于肝內(nèi)膽管癌的診斷、潛在標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和探究疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等機(jī)制的研究。通過分析獲得的無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組對(duì)健康組和肝內(nèi)膽管癌患者組進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析、差異蛋白質(zhì)篩選和差異蛋白質(zhì)生物信息分析,對(duì)肝內(nèi)膽管癌的疾病機(jī)制有了進(jìn)一步的了解。同時(shí),與血清蛋白質(zhì)組分析相比,血清外泌體蛋白質(zhì)組分析能夠獲得更多差異蛋白質(zhì)和生物學(xué)信息;雖然兩者獲得的信息有所差異,但是也證明了外泌體作為組學(xué)分析樣本的價(jià)值及在診斷領(lǐng)域應(yīng)用的潛力。