郭澤華, 羅 芳, 李 思, 樊柳蔭, 伍貽新, 曹成喜*

(1. 上海交通大學(xué)電子信息與電氣工程學(xué)院儀器科學(xué)與工程系, 上海 200240; 2. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240; 3. 上海交通大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新中心, 上海 200240; 4. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌科, 上海 200230)

血紅蛋白A1c(HbA1c)是人類紅細(xì)胞中糖化血紅蛋白(Hb)的主要成分,由葡萄糖分子或其他還原性糖分子與血紅蛋白A的β鏈之間通過(guò)非酶促縮合反應(yīng)形成[1,2]。在糖尿病篩查研究中,一些研究者利用電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)了HbA1c,并證明HbA1c是糖尿病診斷的重要標(biāo)志物[3-5]。在人血紅細(xì)胞的120天細(xì)胞生長(zhǎng)周期中,HbA1c含量與人體內(nèi)血糖濃度正相關(guān),可以用來(lái)反映最近2～3個(gè)月時(shí)間內(nèi)的血糖控制。因此,HbA1c含量常被用于評(píng)估糖尿病的長(zhǎng)期血糖控制情況[3-5]。

目前,人血HbA1c檢測(cè)方法有30種以上[6,7],其中,陽(yáng)離子交換高效液相色譜(CX-HPLC)是主要方法,能夠較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床血樣HbA1c的檢測(cè)。HPLC具有穩(wěn)定、線性好和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),能夠滿足大量糖尿病臨床診斷的需求[8]。在臨床血樣CX-HPLC圖譜中,主要有HbA1a、HbA1b、HbA1c和HbA0峰[9,10],但在大多數(shù)CX-HPLC圖譜中,在主峰HbA0的左側(cè)始終存在未知峰(見圖1)。Little等[9]與Rohlfing等[10]指出，未知峰P3的出現(xiàn)常會(huì)導(dǎo)致CX-HPLC檢測(cè)可信度的喪失。但是,目前對(duì)CX-HPLC中未知峰P3的信息了解非常少。

研究[11-13]提示未知峰可能是HbA3。HbA3是一種谷胱甘肽化的Hb產(chǎn)物,性質(zhì)較為穩(wěn)定,在人紅細(xì)胞中濃度較低[14,15]。但在人體遭受強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激時(shí)(如吸煙和藥物作用),血液中的HbA1c會(huì)與谷胱甘肽結(jié)合,導(dǎo)致HbA3濃度顯著上升,使HbA1c檢測(cè)結(jié)果低于真實(shí)值[16-19],影響臨床診斷結(jié)果。Jeppsson等[20]利用高分辨Mono-S色譜柱實(shí)現(xiàn)了HbA3與HbA1c之間的高效分離?；谖㈥嚵械入娋劢?IEF)電泳,我們[21-24]從真實(shí)血樣中分離純化了HbA3,并利用質(zhì)譜和酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技術(shù)對(duì)HbA3進(jìn)行了鑒定和含量測(cè)定,結(jié)合Mono-S-HPLC技術(shù),證實(shí)了HbA3的生物合成造成HbA1c檢測(cè)結(jié)果的降低[22]。雖然HbA3在Mono-S-HPLC和微陣列IEF中已得到鑒定,但至今仍不清楚HbA3在低分辨CX-HPLC譜圖中的相對(duì)位置。

Peak No.NameCalibrated area/%Area/%Retentiontime/minPeak area1HbA1a-1.10.17 239682HbA1b-1.00.32217893HbF-0.50.5895774HbLA1c-0.80.75173805HbA1c5.2-0.99746216P3-3.11.53650797P4-1.61.62349108HbA0-87.31.731850039圖 1 新鮮血樣通過(guò)VARIANT Ⅱ CX-HPLC系統(tǒng)得到的HbA1c分析結(jié)果Fig. 1 Analytical result of HbA1c in fresh blood samples by VARIANT Ⅱ CX-HPLC system%A1c: calibrated area of hemoglobin A1c (HbA1c).

針對(duì)以上問(wèn)題,本文在前期工作[21-26]的基礎(chǔ)上結(jié)合微陣列IEF和高分辨的Mono-S-HPLC方法進(jìn)一步推測(cè)在臨床低分辨CX-HPLC中HbA3與P3峰的相關(guān)性,討論了其對(duì)糖尿病診斷的影響,為臨床研究和潛在應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

臨床Bio-Rad VARIANT Ⅱ全自動(dòng)血紅蛋白分析儀,即現(xiàn)廣泛用于臨床糖尿病HbA1c值檢測(cè)的CX-HPLC設(shè)備(Hercules,美國(guó)),該儀器使用陽(yáng)離子交換柱與Bis-Tris/磷酸鹽緩沖液,為全自動(dòng)封閉型檢測(cè)設(shè)備。Mono-S-HPLC色譜儀為配備了Mono S 5/50 GL陽(yáng)離子交換色譜柱[20](GE Healthcare Life Sciences,美國(guó))的HPLC系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))。該儀器為手動(dòng)開放型檢測(cè)設(shè)備,用戶可以對(duì)設(shè)備、方法和緩沖液進(jìn)行調(diào)整,其中5/50指5/50 mm, 5 mm指色譜柱前的預(yù)柱長(zhǎng)度,50 mm為該色譜柱長(zhǎng)度。Mettler-Toledo Delta 320 pH計(jì)(梅特勒-托利多集團(tuán),上海)。微陣列IEF設(shè)備(上海伯楷安生物科技有限公司,上海),用于紅細(xì)胞中不同種類的Hb高分辨分離與微量制備純化,該設(shè)備的詳細(xì)信息詳見本課題組其他工作[22-26]。

丙二酸二鈉(純度>99%)購(gòu)自TCI(日本東京)。氯化鋰(純度99%)購(gòu)自阿法埃莎化學(xué)有限公司(天津)。丙烯酰胺(超純級(jí),純度>99.9%)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司(上海)。亞甲基雙丙烯酰胺(超純級(jí),純度>99.9%)和四甲基乙二胺(TEMED)(純度>99%)購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó))。IEF微陣列分離柱(pH 6～8,長(zhǎng)度20 mm×厚度10 μm×寬度1.2 mm)和載體兩性電解質(zhì)(carrier ampholytes (CA), pH 6～8)購(gòu)自上海伯楷安生物科技有限公司(上海)。其他化學(xué)藥品均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司(上海)。超純水使用超純水系統(tǒng)(亞榮,上海)制備。

1.2 樣品準(zhǔn)備

人體血液樣本取自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院參加體檢的志愿者,其采集和檢測(cè)結(jié)果的告知均符合醫(yī)院的操作要求以及醫(yī)療道德規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。新鮮血樣的HbA1c結(jié)果由臨床醫(yī)院使用的VARIANT Ⅱ CX-HPLC系統(tǒng)檢測(cè)得到。

血樣預(yù)處理[20]:將全血樣品采集到含有EDTA抗凝劑的試管中,4 ℃保存,預(yù)處理在采集后24 h內(nèi)完成。將血樣離心15 min以除去血漿。將紅細(xì)胞懸浮于3倍體積的0.15 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4, 0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl)中洗滌3次,然后加入0.4 mL四氯化碳并混合15 min,最后將混合物離心(約6 000 g)10 min,并提取含Hb的上清液。為了防止Hb在Mono-S-HPLC和微陣列IEF儀器中發(fā)生自氧化,向混合溶液通入一氧化碳1～2 min使其飽和,4 ℃保存。血樣中Hb的谷胱甘肽化參照文獻(xiàn)[22,27]中的方法。取制備好的血樣1 mL、0.15 mol/L磷酸鹽-氯化鈉緩沖液1 mL、10 μmol/L谷胱甘肽1 mL和純水3 mL混合并調(diào)節(jié)pH至7.0;然后將混合后的樣品(0.5 mL)轉(zhuǎn)移到裝有0.2 mg乙?；诫碌腅ppendorf管中,并在37 ℃下孵育1 h。通過(guò)與乙酰苯肼一起孵育,使谷胱甘肽與血紅蛋白反應(yīng),生成谷胱甘肽化Hb,即HbA3。將孵育的混合物離心10 min以去除血紅蛋白顆粒沉淀,然后用CX-HPLC和Mono-S-HPLC分析樣本中HbA3的含量。

1.3 HPLC分析

臨床低分辨CX-HPLC系統(tǒng):放置樣品至室溫,在高離子強(qiáng)度的Bis-Tris/磷酸鹽緩沖液環(huán)境下,分離柱中的血紅蛋白與柱基質(zhì)由于離子相互作用而分離,最后用光度計(jì)檢測(cè)分離后的血紅蛋白在415 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

高分辨Mono-S-HPLC系統(tǒng)[20,22]:分離柱為Mono S 5/50 GL陽(yáng)離子交換色譜柱;柱溫為25 ℃;流動(dòng)相A為10 mmol/L的丙二酸鈉和0.2 g/L疊氮化鈉的混合溶液(pH 5.7),流動(dòng)相B為0.3 mol/L的氯化鋰溶液,使用前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾;流速為2 mL/min。洗脫程序:0～5.5 min, 0.2%B; 5.5～7.5 min, 40%B; 7.5～12 min, 50%B; 12～14 min, 100%B; 14～20 min, 0.2%B。檢測(cè)波長(zhǎng)為415 nm,進(jìn)樣量為0.2 μL。

1.4 微陣列IEF及微量Hb的制備純化

微陣列IEF分離血紅蛋白:詳細(xì)IEF分析方法介紹見文獻(xiàn)[22,24]。所用聚焦電泳分離柱為IEF微分離柱(pH 6～8,長(zhǎng)度20 mm×厚度10 μm×寬度1.2 mm)。將處理好的溶血樣本與CA混合,最終樣本中CA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%,血樣稀釋900倍。電場(chǎng)程序設(shè)置:0～2 min, 40 V; 2～4 min, 80 V; 4～6 min, 120 V; 6～120 min, 600 V。進(jìn)樣量為20 μL。

微量Hb制備純化:同一樣本同時(shí)進(jìn)行12根微陣列柱上樣,同步進(jìn)行微陣列IEF聚焦電泳實(shí)驗(yàn)[22,24]。在微陣列IEF結(jié)束后,取出IEF微陣列柱,在解剖鏡下利用解剖刀從12根微陣列柱中分別切下HbA3、HbA1c以及HbA0組分。合并同類Hb組分,放置在離心管中用水溶液提取;之后對(duì)提取的Hb開展Mono-S-HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CX-HPLC未知峰

圖1是臨床CX-HPLC系統(tǒng)對(duì)新鮮血樣(24 h內(nèi)采集)進(jìn)行分析的結(jié)果。樣品中HbA1c的值為5.2%。在色譜圖中HbA0峰面積最大,同時(shí)也檢測(cè)了糖化Hb次要成分，包括HbA1a和HbA1b,但所報(bào)告色譜圖結(jié)果中未提及HbA3;正常生理?xiàng)l件下血液中HbA3含量通常在2%～4%之間,高于HbA1a和HbA1b的含量[28-30],顯然不應(yīng)將HbA3忽略。

圖 2 健康成人血紅細(xì)胞中血紅蛋白成分的微陣列IEF電泳圖譜Fig. 2 Electropherogram of microarray isoelectric focusing (IEF) of hemoglobin species from human adult red blood cells The upper panel shows the IEF image. The lower panel shows the position and relative contents of HbA3, HbA1c, and HbA0.

圖 3 新鮮血樣與微陣列IEF分離所得各血紅蛋白成分的Mono-S-HPLC譜圖Fig. 3 Mono-S-HPLC chromatograms of a fresh blood sample and main Hb fractions extracted from microarray IEF (a) normal blood sample; (b) HbA1c, (c) HbA3, and (d) HbA0fraction corresponding to HbA1c, HbA3, and HbA0 in Fig. 2.

2.2 基于IEF和Mono-S-HPLC的HbA3鑒定

一些Hb變異體會(huì)影響陽(yáng)離子交換HPLC法測(cè)量HbA1c的結(jié)果[31,32],因此,補(bǔ)充HbA3信息能增強(qiáng)色譜圖的可信度。在對(duì)Hb樣品進(jìn)行人工谷胱甘肽化之前,首先用微陣列IEF對(duì)含有5.2% HbA1c的血液樣品進(jìn)行分析[22-24]。如圖2所示,根據(jù)Battelino等[32]的報(bào)道和本課題組前期研究結(jié)果[22],從陽(yáng)極側(cè)到陰極側(cè),得到的主要Hb成分依次為HbA3、HbA1c和HbA0。為了進(jìn)一步確認(rèn),本研究用Mono-S-HPLC對(duì)新鮮血樣進(jìn)行再次分析[20],結(jié)果如圖3a所示,該圖顯示了HbA3存在時(shí)血樣中各血紅蛋白成分的分離情況。此外,利用微陣列IEF技術(shù)[21-24]微分離后提取的各個(gè)Hb成分再用Mono-S-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果如圖3b、3c和3d所示,每個(gè)峰保留時(shí)間均與混合樣品分離得到的峰對(duì)應(yīng),同時(shí)基于前期質(zhì)譜鑒定和ELISA測(cè)定結(jié)果[22],圖3驗(yàn)證了HbA3峰的存在。

2.3 交叉分析推測(cè)P3-HbA3峰

為進(jìn)一步確認(rèn)CX-HPLC中的P3峰與Mono-S-HPLC的HbA3峰的關(guān)系,在試管內(nèi)模擬機(jī)體應(yīng)激過(guò)程,加速血液樣本中HbA0的谷胱甘肽化反應(yīng);之后,分別用Mono-S-HPLC和CX-HPLC對(duì)谷胱甘肽化的血樣進(jìn)行分析(見圖4和圖5)。比較圖4和圖3a可以發(fā)現(xiàn),谷胱甘肽化后HbA1c峰明顯降低,而HbA3峰明顯增加;表明谷胱甘肽化降低了血液樣品中HbA1c的含量,而顯著提高了血液樣品中HbA3含量。圖5顯示了圖1血樣谷胱甘肽化后的CX-HPLC結(jié)果,與圖1相比,圖5中大部分峰保留時(shí)間基本與圖1相對(duì)應(yīng),但圖5中P3峰的峰面積相比圖1明顯增大,且遷移時(shí)間由1.53 min(見圖1)延長(zhǎng)至1.58 min(見圖5),推測(cè)圖5中的P3峰變化是由于谷胱甘肽化導(dǎo)致的含量增加而使峰的保留時(shí)間延后,因而推測(cè)P3峰即為HbA3峰。同時(shí),P3/HbA3相對(duì)峰面積明顯提高,與Mono-S-HPLC系統(tǒng)得到的結(jié)果一致(見圖4),再次提示CX-HPLC中的P3峰為Mono-S-HPLC的HbA3峰。

圖 4 谷胱甘肽化樣品的Mono-S-HPLC譜圖Fig. 4 Mono-S-HPLC chromatogram of glutathiolated sample

圖 5 谷胱甘肽化樣品通過(guò)VARIANT Ⅱ CX-HPLC系統(tǒng)得到的HbA1c分析結(jié)果Fig. 5 Analytical results of HbA1c in glutathiolated sample by VARIANT Ⅱ CX-HPLC system

在本課題組的前期研究中,基于微陣列IEF、質(zhì)譜技術(shù)和ELISA方法,我們證明了血樣中HbA3會(huì)造成HbA1c檢測(cè)結(jié)果顯著偏低[22],為了提高糖尿病檢查中HbA1c測(cè)定值的準(zhǔn)確性,結(jié)果中有必要添加HbA3峰的信息,包括保留時(shí)間和相對(duì)峰面積等。但當(dāng)前在對(duì)糖尿病的檢測(cè)評(píng)估中,檢驗(yàn)科醫(yī)師沒(méi)有考慮P3峰或HbA3峰對(duì)HbA1c峰面積的影響;并且,臨床醫(yī)生依賴自身的經(jīng)驗(yàn),不可避免地存在主觀因素的影響。本研究推測(cè)了HbA3峰在CX-HPLC中的相對(duì)位置,利用IEF、Mono-S-HPLC推測(cè)CX-HPLC中未知P3峰是HbA3峰。相關(guān)研究結(jié)果有望提高糖尿病血樣的HbA1c檢測(cè)結(jié)果的可信度。

3 結(jié)論

在本文中,我們通過(guò)Mono-S-HPLC、微陣列IEF和臨床CX-HPLC系統(tǒng)的交叉分析推測(cè)了先前工作[22]中提到的未知P3峰即為HbA3峰,并確定了其在各個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中的相對(duì)位置。此外,本文基于前期工作[22],并通過(guò)比較谷胱甘肽化和非谷胱甘肽化血樣的交叉分析結(jié)果,討論了HbA3對(duì)糖基化血紅蛋白檢測(cè)的明顯干擾。