鞏麗萍, 石 峰, 宿書芳, 謝強(qiáng)勝, 咸瑞卿, 杭寶建, 趙艷霞

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 國家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 濟(jì)南 250101)

阿膠是以馬科動(dòng)物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠,其主要成分為驢皮膠原蛋白[1]。阿膠的檢測(cè)方法有差示掃描量熱法、凝膠電泳鑒別法、二維相關(guān)紅外光譜法等分析方法[2-4],可分別用于不同來源的阿膠的檢測(cè)。這些方法都是蛋白質(zhì)類成分的通用檢測(cè)方法,專屬性不強(qiáng)。

目前動(dòng)物皮源成分的檢測(cè)方法主要為熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-11]。熒光定量PCR法能鑒定馬、牛、豬、駱駝、鹿等皮源材料,實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物皮源材料的快速檢測(cè)。阿膠是以驢皮熬制而成,經(jīng)過熬制過程的阿膠,其所含動(dòng)物皮源的DNA大部分被破壞,無法獲取動(dòng)物皮源中真實(shí)的DNA,因此利用PCR法難以實(shí)現(xiàn)阿膠的真?zhèn)舞b別。膠原蛋白為不同物種皮的主要成分,經(jīng)高溫熬制后成為不完全水解的肽段,再經(jīng)胰蛋白酶酶切后可形成物種特異性的多肽。質(zhì)譜法主要是通過獲取動(dòng)物皮源特征肽段的相對(duì)分子質(zhì)量信息實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)種類的鑒別[11-15],具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性、易操作性等優(yōu)點(diǎn),可用于阿膠的鑒別。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)引入同位素內(nèi)標(biāo)建立了阿膠中驢皮源成分的檢測(cè)方法,相比于現(xiàn)有檢測(cè)方法分析時(shí)間短,定量更準(zhǔn)確,檢測(cè)效率提高,可用于阿膠中驢皮源成分的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB SCIEX Triple Quad 5500超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB公司); KQ-300GDV型恒溫?cái)?shù)控超聲器(昆山市超聲儀器有限公司); Vortex-6渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); FW-80高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純,美國賽默飛公司),甲酸(色譜純,美國ACS恩科化學(xué)公司),胰蛋白酶(序列分析純,西格瑪公司),去離子水(18.2 MΩ·cm,由Millipore Mili-Q Advantage超純水系統(tǒng)制得),碳酸氫銨(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

對(duì)照品:驢源多肽A1(C41H68N12O13),純度≥91.5%;驢源多肽A2(C51H82N18O18),純度≥94.2%,購于中國食品藥品檢定研究院。驢源多肽A1同位素內(nèi)標(biāo)(C41H68N10O13-15N2),純度95.8%;驢源多肽A2同位素內(nèi)標(biāo)(C51H82N16O18-15N2),純度94.6%,由上海強(qiáng)耀生物有限公司合成。

樣品:阿膠樣品為生產(chǎn)企業(yè)提供及市售樣品,共29批。

1.2 溶液配制

驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0 g/L):準(zhǔn)確稱取驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確至0.1 mg),分別置于10 mL容量瓶中,用1% (1 g/100 mL,下同)碳酸氫銨溶液溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

驢源多肽A1、A2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0 g/L):配制過程同驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(20 mg/L):分別準(zhǔn)確吸取驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各200 μL于10 mL容量瓶,用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,臨用現(xiàn)配。

混合內(nèi)標(biāo)工作溶液(10 mg/L):分別準(zhǔn)確吸取驢源多肽A1、A2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各100 μL于10 mL容量瓶中,用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L混合內(nèi)標(biāo)工作溶液,臨用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的配制:分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液適量,分別加入一定量混合內(nèi)標(biāo)工作溶液,用1%碳酸氫銨溶液稀釋,配制成質(zhì)量濃度為50、100、250、500、1 000、1 250 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為200 μg/L),供UHPLC-MS/MS測(cè)定。

胰蛋白酶溶液: 取胰蛋白酶適量,加1%碳酸氫銨溶液溶解,制成每1 mL中含1 mg的溶液。

1.3 樣品前處理

取樣品約10 g,置于粉碎機(jī)中粉碎并通過試驗(yàn)篩(孔徑0.25～0.45 mm),混勻。稱取粉碎好的樣品0.1 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL容量瓶中,加1%碳酸氫銨溶液40 mL,超聲處理30 min至樣品完全溶解,加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,搖勻。準(zhǔn)確吸取1.00 mL于5 mL容量瓶中,加胰蛋白酶溶液1.0 mL,再加入混合內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL,用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,搖勻,置于恒溫箱中,于37 ℃恒溫酶解16 h,取出,冷卻至室溫,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,待上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜、質(zhì)譜條件

液相色譜條件:色譜柱為Waters XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,B為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫程序:0～1 min, 10%B; 1～5 min, 10%B～30%B; 5～5.1 min, 30%B～70%B; 5.1～7 min, 70%B; 7～7.1 min, 70%B～10%B; 7.1～10 min, 10%B。流速為0.3 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源溫度:550 ℃。定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表 1 驢源多肽A1、A2的質(zhì)譜采集離子信息

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

根據(jù)驢源多肽A1、A2的特性,本實(shí)驗(yàn)比較了在不同色譜柱BEH Shiled RP C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)、BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)上驢源多肽A1、A2的色譜保留行為。結(jié)果表明不同色譜柱上驢源多肽A1、A2的保留時(shí)間不同,但均能通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相中有機(jī)相的比例,實(shí)現(xiàn)驢源多肽A1、A2與基質(zhì)中干擾組分的有效分離。考慮方法的通用性,推薦使用壓力小的XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)為分析色譜柱。

2.2 流動(dòng)相的選擇及洗脫條件

選用乙腈-0.1%甲酸水溶液(流動(dòng)相1)、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(流動(dòng)相2)兩種流動(dòng)相體系進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明,采用流動(dòng)相2時(shí)得到的驢源多肽A1、A2的離子信號(hào)要優(yōu)于采用流動(dòng)相1,這是由于有機(jī)相中酸的加入,保證了流動(dòng)相在梯度變化過程中氫離子濃度的穩(wěn)定性,提高了被分析化合物的離子化效率。因此,本法最終選擇0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

通過優(yōu)化流動(dòng)相的初始比例,使驢源多肽A1、A2的保留時(shí)間適中且峰形對(duì)稱。驢源多肽A1、A2及其同位素內(nèi)標(biāo)溶液(50 mg/L)的MRM色譜圖見圖1。

圖 1 特征肽及其同位素內(nèi)標(biāo)溶液的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of two marker peptides and their isotope interal standards

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/L)通過蠕動(dòng)泵(流速10 μL/min)進(jìn)樣,通過一級(jí)全掃描找到驢源多肽A1、A2的母離子,再分別以一級(jí)母離子通過二級(jí)全掃描找到二級(jí)碎片離子,并通過不斷改變碰撞能使碎片離子響應(yīng)增強(qiáng),通過優(yōu)化獲得最佳離子源參數(shù),確定碎裂電壓及碰撞能量。

2.4 酶解條件的優(yōu)化

采用胰蛋白酶水解阿膠,適宜的酶解溫度為35～40 ℃,根據(jù)該酶的特性及使用說明書,本方法采用酶解溫度為37 ℃。

酶解時(shí)間的考察:固定酶解溫度(37 ℃)和酶用量(加胰蛋白酶溶液1.0 mL),考察酶解時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,比較了不同酶解時(shí)間(0、1、2、4、6、8、16、24、40 h)產(chǎn)生的驢源多肽A1、A2的峰面積,結(jié)果見圖2。由圖2可以看出,隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng),驢源多肽A1、A2的含量逐漸升高,當(dāng)酶解時(shí)間超過16 h以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,說明酶解反應(yīng)趨于完全,因此本方法選擇酶解時(shí)間為16 h。

圖 2 不同酶解時(shí)間下監(jiān)測(cè)離子的峰面積Fig. 2 Peak areas of monitoring ions at different enzymatic hydrolysis times

酶的用量:固定酶解溫度(37 ℃)和酶解時(shí)間(16 h),考察酶的用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可以看出,在胰蛋白酶質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí),酶的用量超過1.0 mL以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,說明當(dāng)酶的用量為1.0 mL時(shí),足以完全酶解樣品,綜合考慮到成本等問題,本方法選擇酶的用量為1.0 mL。

圖 3 不同酶用量下監(jiān)測(cè)離子的峰面積Fig. 3 Peak areas of monitoring ions at different enzyme dosages

2.5 定量方式的確定與基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行基質(zhì)復(fù)雜樣品分析,其復(fù)雜基質(zhì)可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響,因此在方法建立時(shí)需對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)[16]。本方法測(cè)定的目標(biāo)物為阿膠經(jīng)酶解產(chǎn)生的驢源性多肽,由于無法獲得不含驢源性多肽A1、A2的空白基質(zhì),因此以牛皮膠代替評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)[17,18]。取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按1.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的配制過程制備系列純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作溶液(不含內(nèi)標(biāo));取牛皮膠按照1.3節(jié)制得酶解前的樣品溶液,以該溶液配制5倍濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(不含內(nèi)標(biāo)),再按照1.3節(jié)樣品酶解步驟酶解,作為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,按文獻(xiàn)[19]中基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算方法對(duì)絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示驢源多肽A1、驢源多肽A2的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)分別是37.5%、39.2%,說明基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng),需要消除或降低基質(zhì)效應(yīng)。本方法采用同位素內(nèi)標(biāo)法消除基質(zhì)效應(yīng),按上述操作重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(含內(nèi)標(biāo)),再次評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)分別為4.9%、5.2%,基質(zhì)效應(yīng)明顯降低,表明純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法可確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及定量限

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)得峰面積,以目標(biāo)物峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)Y,對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明在50～1 250 μg/L范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(見表2)。測(cè)定的29批樣品中驢源多肽A1的含量為216～414 μg/L,驢源多肽A2的含量為293～357 μg/L,所測(cè)試樣濃度均在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋,以10倍信噪比的峰高對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限,均為10 μg/L,折合到阿膠中含量為20 mg/kg(見表2)。

表 2 特征肽的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)及定量限

2.7 穩(wěn)定性研究

為研究驢源多肽A1、A2溶液的穩(wěn)定性,本方法考察了驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及阿膠經(jīng)酶解產(chǎn)生的驢源多肽A1、A2的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)考察了標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液在-20 ℃下放置1、3、7、10、15、33天的穩(wěn)定性,結(jié)果表明放置10天時(shí)濃度開始下降,因此應(yīng)注意標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的使用時(shí)間;分別考察了室溫下放置0、1、3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24 h的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 000 μg/L)及阿膠經(jīng)酶解后樣品溶液中目標(biāo)肽段的峰面積變化情況,結(jié)果表明在被考察的24 h內(nèi),驢源多肽A1、A2在標(biāo)準(zhǔn)溶液中峰面積的RSD值分別為3.2%、5.9%,在樣品溶液中峰面積的RSD值分別為6.8%、9.1%,穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率

本方法通過向樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的驢源多肽A1、A2標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn),計(jì)算方法回收率,結(jié)果見表3。驢源多肽A1、A2的回收率范圍為103.2%～108.3%,各濃度水平平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%～3.0%,完全能夠滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。

表 3 3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率及RSD (n=6)

2.9 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)以及市售阿膠樣品進(jìn)行測(cè)定,得到不同廠家不同工藝共29批次阿膠中驢源多肽A1、A2的含量之和。不同廠家因生產(chǎn)工藝、原料等不同,所測(cè)得的食品阿膠中驢源多肽A1、A2的含量之和存在差異,含量為0.096%～0.180%,平均值為0.151%。其中1批試樣中驢源多肽A1、A2含量之和小于0.10%;從6批含量較低的阿膠試樣中,應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的分析方法[14]檢出豬皮源、馬皮源成分。

3 結(jié)論

本文建立了UHPLC-MS/MS測(cè)定阿膠中驢皮源成分含量的方法,考察了酶的用量、酶解時(shí)間,進(jìn)行了基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估,采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,方法準(zhǔn)確度高。樣品測(cè)定結(jié)果表明不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品驢源多肽含量差異較大,提示部分生產(chǎn)企業(yè)需改進(jìn)工藝提升產(chǎn)品品質(zhì)。本方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠,重現(xiàn)性好,可用于阿膠中驢皮源成分的測(cè)定。