陳志輝， 周銳， 唐瑩， 周岱翰

1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學腫瘤研究所，廣東 廣州 510405

在全世界范圍內(nèi)，惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一，因其具有高發(fā)病率、高復發(fā)率、高死亡率等特點而備受關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球新增癌癥患者1 810萬，我國占380.4萬例，其中肺癌的發(fā)病率為11.8%，病死率為18.4%[1]。而非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC）約占了所有類型肺癌的80%，且五年生存率低于10%[2]。目前NSCLC的治療主要有手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療、免疫治療和中醫(yī)藥治療等。其中，中醫(yī)藥在治療NSCLC方面具有獨特優(yōu)勢，除了可延長患者生存期，還可減少放化療和分子靶向治療的毒副反應[3-4]。

鶴蟾片是國醫(yī)大師周岱翰教授的經(jīng)驗方，有多年的臨床應用基礎(chǔ)。鶴蟾片主要由仙鶴草、干蟾皮、半夏、天冬、浙貝母、貓爪草、葶藶子、魚腥草、人參組成，方中干蟾皮清熱解毒，利水消脹；仙鶴草補虛止血；半夏、貓爪草、浙貝母化痰散結(jié)；魚腥草清熱解毒，消癰排膿；葶藶子瀉肺平喘，利水消腫；天冬養(yǎng)陰潤燥，清肺生津；人參大補元氣，補脾益肺，全方配伍，具有解毒除痰、凉血養(yǎng)陰、消癥散結(jié)等功效，用于治療原發(fā)性支氣管肺癌及肺部轉(zhuǎn)移[5]。目前已有多項研究表明，鶴蟾片具有抑瘤作用。周岱翰等[5]用鶴蟾片治療102例晚期肺癌患者(單服鶴蟾片組62例，手術(shù)治療配合鶴蟾片組31例，化療配合鶴蟾片組9例）。其中單服鶴蟾片組，顯效6例，有效33例，總體有效率為62.9%，平均生存時間7.66個月；手術(shù)治療配合鶴蟾片組有效26例，平均生存時間9.1個月；化療配合鶴蟾片組顯效1例，有效4例，平均生存時間6.1個月。鶴蟾片對于肺癌的治療具有較好的臨床療效，而此次的研究也獲得了全國中醫(yī)藥重大科技成果乙等獎。熊紹權(quán)等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鶴蟾片含藥血清對人肺腺癌A549細胞具有生長抑制作用，并證實為通過誘導細胞凋亡途徑，其分子機制可能與抑制EGFR基因的轉(zhuǎn)錄表達有關(guān)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點-非小細胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合生物學信息分析，探索更多有關(guān)鶴蟾片治療NSCLC的潛在靶點及作用機制。

1 材料與方法

1.1 鶴蟾片化學成分收集與篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）尋找鶴蟾片(仙鶴草、干蟾皮、半夏、天冬、浙貝母、貓爪草、葶藶子、魚腥草、人參）9味中藥化學組成成分，根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性(drug likeness，DL）≥ 0.18的2個體外藥代幼力學屬性值進行活性成分的初步篩選，并根據(jù)已發(fā)表的文獻報道補充未預測到的活性成分。

1.2 中藥活性成分靶點預測與共同靶點篩選

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取中藥活性成分的結(jié)構(gòu)，將其2D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式。將活性成分結(jié)構(gòu)導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch）中進行靶點預測，以獲取活性成分的靶點。其中把Probability＜0.1的靶點及未能預測到的活性成分進行剔除。

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org）檢索“非小細胞肺癌”靶點，以Score值為條件獲取疾病靶點。將中藥活性成分預測靶點與非小細胞肺癌疾病靶點取交集，獲得成分-疾病共同靶點。之后使用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點-非小細胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)，篩選出主要活性成分。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將交集靶點提交至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org）構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(＞0.9），其余設(shè)置均為默認設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導入Cytoscape 3.8.2進行可視化，并使用Network Analyzer功能計算Degree值，根據(jù)Degree值篩選核心靶點。

1.4 GO功能富集與KEGG通路富集

使用R軟件3.6.2中的“clusterProfiler”包對核心靶點進行富集分析，包括基因本體論(gene ontology，GO）和生物學通路(biological pathway）富集分析，使用Bonferroni檢驗法校正P值，并設(shè)定P＜0.05，篩選出具統(tǒng)計學意義的生物學過程和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 鶴蟾片活性成分的篩選及靶點的獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以及已發(fā)表的相關(guān)文獻報道檢索鶴蟾片的活性成分，其中仙鶴草41個，干蟾皮30個，半夏116個，天冬32個，浙貝母17個，貓爪草79個，葶藶子68個，魚腥草50個，人參190個。根據(jù)ADME篩選后獲得活性成分共99個，其中仙鶴草5個，干蟾皮12個，半夏13個，天冬9個，浙貝母7個，貓爪草12個，葶藶子12個，魚腥草7個，人參22個。將99個中藥活性成分導入PubChem數(shù)據(jù)庫，剔除無法獲得結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)種類不明確的活性成分，最終得到活性成分72個，其中仙鶴草4個，干蟾皮8個，半夏12個，天冬6個，浙貝母6個，貓爪草8個，葶藶子9個，魚腥草5個，人參14個(見表1）。將72個活性成分導入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，共得到預測靶點3 233個，去除重復靶點后，得到活性成分靶點772個。

表1 鶴蟾片的活性成分Table 1 Active components of He Chan Tablets

2.2 非小細胞肺癌疾病相關(guān)靶點的獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到非小細胞肺癌相關(guān)靶點共計19 240個，根據(jù)經(jīng)驗，若靶點過多則設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標靶點為非小細胞肺癌的潛在靶點。因此選取Score≥37.16的1 204個靶點作為非小細胞肺癌的潛在靶點。

2.3 鶴蟾片活性成分-非小細胞肺癌共同靶點的獲取

將篩選的772個鶴蟾片活性成分靶點與非小細胞肺癌的1 204個靶點取交集，得到交集靶點228個(見圖1）。將72個鶴蟾片活性成分與228個潛在靶點，通過Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點-非小細胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)(見圖2），經(jīng)過NetworkAnalyzer網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后，得出度值(Degree）最高的5個活性成分(見表2），這5個成分可能是鶴蟾片治療NSCLC的主要活性成分。

圖1 鶴蟾片活性成分靶點與非小細胞肺癌靶點韋恩圖Figure 1 Venn Diagram of relationship between active components targets of HeChan Tablets and NSCLC potential targets

圖2 鶴蟾片活性成分-非小細胞肺癌靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The “compound-target-disease” network of HeChan tablets and NSCLC.（The blue nodes represent the active components of HeChan tablets；The green nodes represent potential targets；The red nodes represent HeChan tablets；The size of the nodes represent the degree）

表2 鶴蟾片度值排名前5的主要活性成分Table 2 The main five active components of He Chan Tablets

2.4 核心靶點的篩選及可視化

將228個共同靶點導入String 11.0數(shù)據(jù)庫檢索其相互作用的蛋白，得到216個節(jié)點(其中SCN9A、 PLA2G2A、 P2RX7、 HNF4A、 GBA、TYR、HPGD、ANPEP、ROS1、MIF、CHRNA3、NQO2無相互作用，故剔除），1574條邊，置信度≥0.90的PPI網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape 3.8.2進行篩選核心靶點及可視化，使用Network Analyzer進行拓撲分析后，以degree≥9為篩選條件，最終獲得116個核心靶點和1 513條邊(見圖3）。度值排名前10的核心靶點見表3。

表3 度值排名前10的核心靶點Table 3 The main potential targets of HeChan Tablets

圖3 鶴蟾片-非小細胞肺癌核心靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 The PPI network of the main potential targets between HeChan tablets and NSCLC.（The size of the nodes represent the degree；The colour represent the betweenness centrality）

2.5 核心靶點的富集分析

使用R軟件中的clusterProfiler包對核心靶點進行富集分析。GO分析包括分子功能(Molecular Function， MF）、 生 物 過 程(Biological Process，BP）、和細胞組成(Cellular Component，CC）三個部分，結(jié)果見圖5。MF富集結(jié)果顯示：核心靶點主要涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、激素受體結(jié)合等功能；BP富集結(jié)果顯示：核心靶點主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、蛋白激酶B信號、磷脂酰肌醇介導的信號傳導、磷脂酰肌醇3-激酶信號傳導等生物過程；CC富集結(jié)果顯示：核心靶點主要涉及細胞膜、神經(jīng)元胞體、黏著斑、蛋白激酶復合物、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物等細胞成分。根據(jù)核心靶點通路的富集分析結(jié)果，主要涉及的通路有：PI3K-AKT信號通路、癌癥中的蛋白多糖、非小細胞肺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、前列腺癌、胰腺癌等通路(見圖4）。

圖4 核心靶點的富集分析結(jié)果（注：A：GO-MF分析；B：GO-BP分析；C：GO-CC分析；D：KEGG分析）Figure 4 Result of the GO enrichment analysis（A：GO-Molecular Function；B：GO-Biological Process；C：GO-Cellular Component；D：KEGG pathway）

3 討論

古代并無肺癌病名，文獻中關(guān)于“咳嗽”“肺痿”“痰飲”“肺積”“息賁”等病證的描述與肺癌具有高度相似性。周岱翰教授在多年的臨床實踐過程中，認為肺癌的辨證不離“痰”“瘀”“虛”“毒”四個方面。病機特點總屬“本虛標實”，本虛以肺脾兩虛多見，久病入絡(luò)，病久及腎，標實則痰瘀互結(jié)常見。根據(jù)肺癌的發(fā)病特點將肺癌分為肺郁痰瘀、脾虛痰濕、陰虛痰熱、氣陰兩虛4種證型。鶴蟾片全方配伍，具有解毒除痰、凉血養(yǎng)陰、消癥散結(jié)的功效，切中肺癌“痰”“瘀”“虛”“毒”的辨證特點。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于網(wǎng)絡(luò)觀點從系統(tǒng)水平識別“疾病-表型-基因-藥物”的多層次關(guān)系，體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點-多途徑作用的特征，符合中醫(yī)藥整體觀及組方配伍原則，是中藥研究和新藥發(fā)掘的一種新方法[7]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點-非小細胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)，得出鶴蟾片的5個主要活性成分為：黃芩素(baicalein）、槲皮素(quercetin）、異鼠李素(isorhamnetin）、山柰酚(kaempferol）、五味子酯乙(Gomisin B）。黃芩素屬于黃酮類化合物，研究表明黃芩素具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、抗血栓形成、抗腫瘤和保護肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等作用[8-13]。而黃芩素在非小細胞肺癌方面，主要是通過細胞周期進程、凋亡相關(guān)蛋白及通路、血管生成、上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤微環(huán)境、抗氧化等多方面調(diào)控NSCLC細胞的增殖、凋亡、侵襲、化療敏感性等生物學行為，具有廣泛的抗腫瘤作用[14]。鶴蟾片中的仙鶴草、魚腥草、葶藶子、天冬都含有槲皮素，研究表明槲皮素具有明顯的抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲能力，其機制可能與STAT3信號通路的抑制有關(guān)[15]。羅進勇等[16]發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制肺腺癌A549細胞的生長，其機制可能與上調(diào)促凋亡蛋白p53表達和下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達有關(guān)。朱玲等[17]進行體內(nèi)外研究結(jié)果表明異鼠李素可下調(diào)bcl-2基因、PCNA蛋白表達，上調(diào)抑癌基因P53，bax及caspase-3基因，抑制人體肺腺癌A549細胞生長。張敬等[18]發(fā)現(xiàn)山柰酚可通過抑制雌激素受體相關(guān)受體發(fā)揮降低非小細胞肺癌A549細胞侵襲和遷移能力。劉小東等[19]發(fā)現(xiàn)五味子酯乙能高效逆轉(zhuǎn)肺癌耐紫杉醇A549/Tax細胞對多種化療藥物的耐藥性，其機制可能與抑制P糖蛋白的藥物外排功能和下調(diào)其蛋白表達有關(guān)。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，本研究的核心靶點為PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、AKT1、SRC 等。而根據(jù)KEGG富集分析結(jié)果顯示，PI3K-AKT信號通路為主要通路，其次為癌癥中的蛋白多糖、前列腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、胰腺癌、非小細胞肺癌等通路。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是一種可催化磷脂酰肌醇D3位磷酸化的脂類激酶，在PI3K家族中，研究最廣泛的是能被細胞表面受體所激活的Ⅰ型PI3K。IA型PI3K是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85所組成的二聚體蛋白，具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性[20]。PIK3R1基因編碼表達PI3K的調(diào)節(jié)亞單位p85，而PIK3CA基因編碼表達PI3K的催化亞單位p110。研究表明[21]PI3K在非小細胞肺癌發(fā)展中起重要作用，當PIK3CA基因突變可導致p110α酶活性增強、激活AKT信號、減少細胞對生長因子的依賴、抑制細胞的凋亡和促進腫瘤的侵襲。Akt基因是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶，又被稱為蛋白激酶B，是PI3K下游的作用靶點[20]。研究表明[22]AKT是PI3K/AKT信號通路的核心，激活狀態(tài)的AKT表達升高被證實存在于43%～90%的NSCLC病例中，而且激活狀態(tài)的AKT表達于早期的原發(fā)性腫瘤中的患者往往預后差，且AKT的過度激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。PI3K/AKT通路是NSCLC最常見的調(diào)控途徑之一，其對癌細胞的生存以及疾病的發(fā)生發(fā)展都至關(guān)重要，包括腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細胞凋亡促進血管生成和化療耐藥等都與PI3K/AKT通路相關(guān)[23]。因此阻斷PI3K/AKT信號通路有可能抑制NSCLC的生存途徑并誘導其凋亡。此外，研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）的過度激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[24]。張潔等[25]發(fā)現(xiàn)Src作為胞漿內(nèi)蛋白，能與細胞膜上的許多生長因子受體相互作用，進而激活Src蛋白。激活的Src蛋白使其下游信號發(fā)生瀑布效應，通過組織MAPK以及STAT3信號通路促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[26]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法初步探討了鶴蟾片治療非小細胞肺癌的主要活性成分、核心靶點、信號通路，揭示鶴蟾片是通過多成分、多靶點、多通路共同發(fā)揮藥理作用。但限于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法的局限性，本研究結(jié)果可能出現(xiàn)藥物活性成分及潛在靶點收集不全、或數(shù)據(jù)庫信息未能及時更新所致研究結(jié)果不準確等問題，后續(xù)仍需通過動物和細胞實驗加以佐證。