劉 可，李愛學，李朋朋

(1.河北工程大學 園林與生態(tài)工程學院，河北 邯鄲 056038；2.北京市農(nóng)林科學院 北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心，北京 100097)

0 引 言

碳水化合物的測定和定量在很多領域具有重要意義，無酶電化學傳感器[1～3]因不依賴于酶、成本低、受環(huán)境因素影響小、穩(wěn)定性好、制備方法簡單等優(yōu)點，而越來越受到研究人員的青睞。但現(xiàn)有傳感器的檢測上限較低，不能滿足實際樣品原位、現(xiàn)場檢測的需求，因此還需要進一步研發(fā)新型的碳水化合物傳感器。

碳基納米結(jié)構(gòu)如石墨烯(GR)、碳納米管(MWCNT)、炭黑等，因其非凡的理化性能而受到了廣泛的關(guān)注。MWCNT的良好分散可以避免GR片的聚集[4,5]，GR納米片作為表面活性劑也可以直接分散MWCNT，從而形成比表面積大、電導率優(yōu)良的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[6～8]。此外，金(Au)催化劑因其優(yōu)異的光電特性和催化活性被廣泛應用于傳感器研究中，如葡萄糖氧化、維生素含量的檢測等[9,10]。這種催化作用也可用于催化其他碳水化合物，如果糖、半乳糖、木糖和甘露糖，因為這些糖具有非常相似的結(jié)構(gòu)。叉指電極(interdigital electrodes,IDEs)是指狀或梳狀的面內(nèi)有周期性圖案的電極，其表層為指狀鍍金薄膜，具有靈敏度高、響應速度快、小型一體化等優(yōu)點。

本文介紹了一種無酶檢測碳水化合物的方法，即以陶瓷基底的叉指電極作為基礎電極，利用GR-MWCNT復合材料構(gòu)建3D網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)來固定化AuNPs，形成復合材料，修飾叉指電極，催化氧化碳水化合物。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

羧基化石墨烯和羧基化碳納米管購自先豐納米材料科技有限公司(中國，南京)。D-無水葡萄糖(glucose),D-果糖(fructose),D-半乳糖(galactose)，氫氧化鈉，亞鐵氰化鉀，氯化鉀，檸檬酸三鈉,檸檬酸(citric acid),無水蘋果酸(malic acid)，氯化鎂，無水乙醇購自國藥控股化學試劑有限公司(中國，上海)。氯金酸，Nafion 溶液(質(zhì)量分數(shù)5 %)，D-木糖(xylose)，甘露糖(mannose)，D-亮氨酸(leucine)，DL-色氨酸(tryptophan)購自西格瑪試劑有限公司(美國，密蘇里州圣路易斯)。L-賴氨酸(lysine)和磷酸鹽緩沖溶液(PBS 0.01 mol/L pH 7.4)購自索萊寶科技有限公司(中國，北京)。其余試劑均為分析純，整個實驗均使用超純水制備溶液。

1.2 儀 器

所有的電化學測量都是在 CHI760E 電化學工作站(上海辰華儀器有限公司，中國)上進行的。配備X 射線能譜分析(EDS)的場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)系統(tǒng)(ZEISS，SEM 500，德國)用于研究不同修飾步驟的叉指電極形貌。叉指電極購自廣州鈺芯科技有限公司，線寬為100 μm，由工作電極和對電極組成，另加銀(Ag)/氯化銀(AgCl)電極作為參比電極，構(gòu)成三電極系統(tǒng)，所有電化學測量均在室溫條件(24 ℃)下進行。

1.3 GR-MWCNT-Au復合材料的制備

首先制備0.5 mg/mL GR和1.5 mg/mL MWCNT的混合液。取20 mL GR-MWCNT混合液，在其中加入23.6 mmol/L HAuCl4溶液15 mL，磁力攪拌60 min。隨后在混合液中加入68 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液20 mL，磁力攪拌30 min。后放入溫度為80 ℃ 水浴鍋中加熱30 min。將所得溶液以17 000 r/min的速度離心10 min。吸取上層清液后，放入溫度為60 ℃干燥箱中干燥12 h。收集干燥后的復合材料，以55 mg材料滴加2.5 mL乙醇和55 μL Nafion 溶液為比例進行混合，即為制備好的修飾材料。另外通過制備各種比值的GR-MWCNT 混合液(0︰4,1︰3,2︰2,3︰1,4︰0)和各種濃度的氯金酸溶液(13.6,18.6,23.6,28.6,33.6 mmol/L)對修飾材料濃度進行優(yōu)化。采用滴涂法對電極表面進行修飾，滴加8 μL GR-MWCNT-Au溶液，在室溫(24 ℃)下修飾30 min。具體構(gòu)建過程如圖1所示，每一步驟完成后，用PBS緩沖液對電極進行沖洗。

圖1 GR-MWCNT-Au和碳水化合物傳感器的制備示意

1.4 測量程序

用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry,CV)研究修飾后的電極對各種糖的催化作用，掃描范圍為-0.6～1.0 V，掃速為0.05 V/s。糖的濃度檢測采用計時電流法，工作電壓為0.3 V，掃描時間為300 s。所有電化學測試都是在0.1 mol/L NaOH溶液中進行的。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的形貌和結(jié)構(gòu)表征

圖2是電鏡的表征結(jié)果。由圖2(a)看出，裸IDEs表面光滑，無任何雜質(zhì)。圖2(b)為修飾GR-MWCNT-Au后的IDEs電極，圖2(c)為圖2(b)的放大圖，從圖2(c)中可以明顯的看到片層狀褶皺的GR結(jié)構(gòu)，在GR納米片之間穿插著管狀的MWCNT，金納米粒子分布在GR-MWCNT的表面，尺寸約為30～50 nm。D-H圖顯示了修飾GR-MWCNT-Au后電極的EDS Mapping圖譜，得到了C,F,Au,N,O元素的信號。C元素的存在歸因于GR和MWCNT中的C元素。由于Nafion含有大量F元素，導致F元素的出現(xiàn)。N,O元素來源于石墨烯，復合材料中的Au和叉指電極表面金薄膜是Au元素出現(xiàn)的原因。Mapping圖譜也證明了各種材料已經(jīng)成功修飾在了電極表面。

圖2 裸IDEs(a)、GR-MWCNT-Au/IDEs(b)、GR-MWCNT-Au/IDEs高倍(c)的SEM圖譜，(d)-(h)為GR-MWCNT-Au/IDEs的Mapping圖譜

2.2 傳感器制備過程的電化學表征

首先用CV方法對傳感器的制備過程進行了表征，CV掃描是在1 mmol/L [Fe(CN)6]4-溶液(含0.1 mol KCL)中進行的。CV掃描的電流響應情況如圖3(a)所示，與裸電極相比，當GR-MWCNT-Au材料修飾到電極上后，氧化還原峰電流有所減小，但峰峰電位差也減小。這是因為GR、MWCNT及Au粒子的高導電性和催化性能，提高了電子轉(zhuǎn)移速率、增強了可逆性。CV的表征結(jié)果證實了該傳感器的成功制備。電化學阻抗譜(EIS)在100.0 kHz～0.01 Hz范圍內(nèi)掃描的奈奎斯特曲線如圖3(b)所示，裸電極存在一個較小的半弧。當修飾上GR-MWCNT-Au納米復合材料后，幾乎看不到半弧的存在。圖3(b)的內(nèi)插圖中給出了一個簡單的等效電路模型。裸電極擬合的阻抗值Rct為38.1 kΩ，修飾復合材料之后的阻抗值減小到30.9 kΩ，這是由于GR,MWCNT及Au納米粒子提高了電極的導電性，加速了電子的傳遞。EIS的結(jié)果和CV一致，再次證明了傳感器的制備是成功有效的。

圖3 裸IDEs和GR-MWCNT-Au/IDEs在1mmol/L[Fe(CH)6]4-溶液中的循環(huán)伏安曲線

2.3 GR-MWCNT-Au納米材料的電化學性能

為了檢驗GR-MWCNT-Au納米材料的電化學性能，考察了裸IDEs、GR/IDEs、MWCNT/IDEs和GR-MWCNT-Au/IDEs在-0.6～1.0 V范圍內(nèi)的電化學行為。圖4(a)的內(nèi)插圖為裸電極的在空白溶液(a)及20 mmol/L果糖溶液中(b)的循環(huán)伏安曲線，裸電極在空白溶液中顯示了典型的金的氧化還原行為，在果糖溶液中，可以在0.28 V和0.53 V處觀察到兩個氧化峰，GR/IDEs(c)和MWCNT/IDEs(d)的導電性增強，背景電流增大，但果糖的氧化峰沒有明顯增大。

圖4(a)內(nèi)插圖為裸IDEs在0 mmol/L(a)和20 mmol/L(b)果糖溶液的循環(huán)伏安曲線，裸IDEs(b)、GR/IDEs(c)、MWCNT/IDEs(d)和GR-MWCNT-Au/IDEs(e)在20 mmol/L果糖溶液中的循環(huán)伏安曲線，圖4(b)GR-MWCNT-Au/IDEs在0 mmol/L(a)和20 mmol/L(b)果糖溶液中的循環(huán)伏安曲線，圖4(c)GR-MWCNT-Au/IDEs在和20 mmol/L葡萄糖(a)、甘露糖(b)、半乳糖(c)和木糖(d)中的循環(huán)伏安曲線GR-MWCNT-Au/IDEs(e)獲得了最高的電流響應，氧化峰也更加明顯，這表明GR、MWCNT和AuNPs作為果糖發(fā)生反應的催化劑，結(jié)合后的協(xié)同效應能夠能夠使它們的催化效果進一步放大。所以后續(xù)的實驗選擇使用 GR-MWCNT-Au材料來進行。圖4(b)中曲線(a)為在不添加果糖的情況下，GR-MWCNT-Au/IDEs沒有氧化還原峰出現(xiàn)。在加入20 mmol/L的果糖(b)后，在0.3 V左右的電位處觀察到一個明顯的氧化峰，所以，將氧化峰對應的電壓0.3 V作為后續(xù)i-t法的工作電壓。這種催化作用也發(fā)生在其他碳水化合物，如圖4(c)所示，在20 mmol/L的葡萄糖(a)、甘露糖(b)、半乳糖(c)和木糖(d)中，它們的氧化還原反應類似于果糖，這主要是由于這些碳水化合物和果糖的結(jié)構(gòu)相似，因此GR-MWCNT-Au對它們有產(chǎn)生類似的催化作用[16]。GR-MWCNT-Au修飾電極可以催化氧化這幾種碳水化合物形成對應的酯，酯水解后生成酸。

圖4 電化學性能曲線

2.4 傳感器制備條件的優(yōu)化

首先考察了GR和MWCNT的含量對響應電流I的影響。在本研究中，固定碳納米材料的總量為2 mg/mL，考察了不同配比GR-MWCNT復合材料(4︰0,3︰1,2︰2,1︰3,0︰4)對于響應電流的影響。利用20 mmol/L的果糖檢測其i-t響應，結(jié)果如圖5(a)所示，GR-MWCNT復合材料的響應電流要比單一的GR或MWCNT大。而在GR-MWCNT復合材料的各個配比中，當GR︰MWCNT為1︰3時獲得了最大的電流響應，表明此時GR與MWCNT具有最佳的協(xié)同作用。所以,在本研究中GR和MWCNT的最佳含量分別為0.5 mg/mL和1.5 mg/mL。

金納米粒子是修飾物重要組成部分之一，所以優(yōu)化氯金酸的濃度(13.6,18.6,23.6,28.6,33.6 mmol/L)也是十分有必要的。優(yōu)化結(jié)果如圖5(b)所示，可以看出HAuCl4含量從13.6～23.6 mmol/L時，電流逐漸增大。HAuCl4含量為23.6 mmol/L時獲得了最大的電流響應。而當HAuCl4含量繼續(xù)提高時，響應電流不再增大，所以,HAuCl4含量選擇23.6 mmol/L進行后續(xù)實驗。

滴加的復合材料的總量也影響修飾后電極的性能，這就需要對復合材料的總量(40,45,50,55,60 mg)進行優(yōu)化。結(jié)果如圖5(c)所示，材料的總量為55 mg時，響應電流尤為顯著。因此確定復合材料的總量為55 mg。

最后考察不同電壓(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 V)對響應電流I的影響。如圖5(d)所示，當電壓從0.1 V增加到0.3 V時，響應電流逐漸增大。而電壓從0.3 V開始繼續(xù)增大時，電流出現(xiàn)了下降。所以0.3 V是碳水化合物發(fā)生反應的最佳電壓。

圖5 GR-MWCNT含量比例、HAuCl4濃度、復合材料滴加的質(zhì)量選用的工作電壓對電流響應的影響

2.5 無酶碳水化合物傳感器的性能測試

在最優(yōu)的實驗條件下，采用制備的無酶碳水化合物傳感器測定一系列濃度的糖溶液。果糖在5～120 mmol/L的范圍內(nèi)果糖濃度和響應電流成線性關(guān)系。如圖6,果糖的線性方程為I(mA)=4.446 23+0.112 23C(mmol/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.975，檢測限為0.24 mmol/L(S/N=3)。葡萄糖在10～100 mmol/L的范圍內(nèi)果糖濃度和響應電流成線性關(guān)系。葡萄糖的線性方程為I(mA)=3.676 39+0.256 51C(mmol/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.975，檢測限為3.12 mmol/L(S/N=3)。對于半乳糖、甘露糖和木糖，傳感器也表現(xiàn)了類似的電流響應。傳感器對這幾種碳水化合物的檢測性能如表1所示。與文獻中報道的其他類型的無酶傳感器相比，以果糖傳感器為例(表2)，本文的傳感器檢測范圍更適合對農(nóng)產(chǎn)品及食品進行現(xiàn)場原位檢測，具有較強的實際應用價值。

圖6 GR-MWCNT-Au/IDEs 傳感器對不同濃度果糖和葡萄糖進行檢測的計時電流曲線和校準曲線

表1 碳水化合物傳感器不同糖的特征

表2 不同無酶果糖傳感器的性能比較

為了檢驗傳感器對碳水化合物的選擇性能，使用制備的傳感器分別對20 mmol/L的果糖、蘋果酸、檸檬酸、色氨酸、亮氨酸、賴氨酸和氯化鎂進行檢測，結(jié)果如圖7所示。傳感器對果糖的電流響應顯著高于其他干擾物質(zhì)，不受蘋果酸、檸檬酸、色氨酸、亮氨酸、賴氨酸、Mg2+和Cl-的干擾，證明了傳感器具有良好的選擇性。

圖7 GR-MWCNT-Au/IDEs傳感器選擇性能測試

在同等實驗條件下，采用同一根修飾后的叉指電極，連續(xù)測定6次同一濃度的果糖溶液(20 mmol/L)，并記錄其果糖溶液的電流響應值，結(jié)果如圖8(a)，可見其電流響應值較為一致(RSD為4.25 %)。在同等實驗條件下，用6根修飾后電極對同一濃度的果糖(20 mmol/L)進行10次測量(圖8(b))，響應電流的RSD為4.43 %。這些都顯示出傳感器具有優(yōu)異的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

圖8 同一電極連續(xù)測6次同一濃度果糖和6根電極測同一濃度果糖的計時電流曲線(同一濃度果糖為20 mmol/L)

2.6 實際樣品測試

采用標準加入法，通過檢測橙汁中的碳水化合物，相關(guān)結(jié)果如表3所示，得到橙汁樣品的加標回收率在99.45 %～104.39 %之間，且同一濃度的響應電流值較為一致(n=3)。這表明傳感器的檢測結(jié)果是準確可靠的，可用于實際樣品中碳水化合物的測定。

表3 橙汁加標回收率結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本文研究采用叉指電極，利用石墨烯、碳納米管和金納米粒子的協(xié)同作用催化碳水化合物的氧化反應，制備了幾種碳水化合物的無酶傳感器。傳感器的檢測范圍更適合對農(nóng)產(chǎn)品及食品進行現(xiàn)場原位檢測應用，并且具有良好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性。使用其對橙汁中的碳水化合物含量進行了檢測，獲得了較好的回收率，表明該傳感器具有較高的實際應用價值。這項工作證明了同時檢測多種碳水化合物是可行的。