包益潔，高菲，王東毅，陳進(jìn)寶，吳宏磊，賈琳琳

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200120

結(jié)腸癌是指起源于結(jié)腸黏膜上皮的惡性腫瘤。調(diào)查顯示，我國結(jié)腸癌發(fā)病率位居消化道腫瘤的第3位，且其發(fā)病率逐年增長，5年生存率為50%～60%［1］。但是目前部分結(jié)腸癌患者就診時(shí)已處于中晚期，常規(guī)放化療、靶向治療等綜合療效均不甚理想，患者預(yù)后差，遠(yuǎn)期生存率低［2］。香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》，具有益氣化痰、理氣暢中的功效。研究發(fā)現(xiàn)，香砂六君子湯可提升大腸癌術(shù)后化療患者的生存質(zhì)量［3］。另有報(bào)道，香砂六君子湯配合化療有助于減輕結(jié)腸癌患者的臨床癥狀，較單純化療患者效果更佳［4］。PI3K/Akt是調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、分化和遷移的經(jīng)典信號通路，阻斷該通路可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖［5-6］。Bcl-2/Bax通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡程序的常見通路，可誘發(fā)線粒體途徑所致的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高人結(jié)腸癌細(xì)胞株的凋亡率［7-8］。但香砂六君子湯對結(jié)腸癌腫瘤生長的具體作用機(jī)制尚不清楚，是否能通過調(diào)控PI3K/Akt、Bcl-2/Bax信號通路抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡也未明確。鑒于此，本研究旨在為香砂六君子湯輔助結(jié)腸癌抗腫瘤治療的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞50只BALB/c裸鼠，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，清潔級，購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2019-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，12 h光照12 h黑暗，溫度18～22℃，相對濕度50%～60%。倫理批號：SHUTCM20190204。

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26（中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，貨號：031516802），置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑香砂六君子湯（由人參3 g，白術(shù)6 g，茯苓6 g，炙甘草2 g，陳皮2.5 g，半夏3 g，木香2 g，砂仁2.5 g，生姜6 g組成，福州同春醫(yī)藥有限公司，批號：20180415、20180613、20180911、20190212、20190123、20190105、20190114、20180905、20180724）；奧沙利鉑［齊魯制藥（海南）有限公司，批號：A131104］。RPMI 1640培養(yǎng)基、配套培養(yǎng)液（美國Gibco公司，貨號：G1216117、G1216138）；蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司，批號：181204A）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：T20180315C）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：B20180427B）；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved-Capase3、單克隆抗體（美國Sigma公司，批號：180617、180712、180715、180622、180913、180423、180719）。

1.3 儀器游標(biāo)卡尺（日本Mitutoyo公司，量程：0～200 mm，精確度：0.01 m）；ACS-15型電子天平（德國Sartorius公司）；CX-41型光鏡（日本Olympus公司）；FC 500型流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）；QPK 212型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（日本Toyobo公司）。

2 方法

2.1 建模、動(dòng)物分組及藥物干預(yù)RPMI培養(yǎng)基（含10%小牛血清＋1%L-谷氨酰胺＋1%青霉素＋1%鏈霉素）培養(yǎng)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26，待貼壁后用0.25%胰蛋白酶消化，離心并棄去消化液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106mL-1。取細(xì)胞懸液在裸鼠頸部背側(cè)皮下接種，每只0.2 mL，10 d后游標(biāo)卡尺測量腫瘤短徑，若＞0.4 cm則認(rèn)為建模成功。將建模成功者按隨機(jī)數(shù)字表分為5組，即模型組、陽性組（奧沙利鉑，1 mg·kg-1）及香砂六君子湯低、中、高劑量組（5.4 g·kg-1、10.8 g·kg-1、21.6 g·kg-1），陽性組尾靜脈注射給藥，其余組大鼠灌胃給藥。每天1次，共4周。

2.2 對裸鼠的腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響干預(yù)后頸椎脫臼法處死裸鼠，迅速、完整剝離腫瘤組織，稱量腫瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率＝（給藥組腫瘤質(zhì)量-空白組腫瘤質(zhì)量）/給藥組腫瘤質(zhì)量×100%

2.3 觀察腫瘤組織病理學(xué)變化取腫瘤組織，固定、脫水、透明、包埋、修剪并連續(xù)切片，厚4μm。蘇木精染色，5 min后流水沖洗5 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，流水沖洗30 s；0.5%伊紅染色3 min，蒸餾水沖洗30 s，梯度濃度乙醇洗脫，二甲苯處理，中性樹膠封固。在高倍光鏡下觀察病理學(xué)變化。

2.4 檢測細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）、凋亡率變化取約15 g腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105mL-1，4℃70%乙醇固定。加Solution A 125μL，10 min后加Solution B 100μL，10 min后加Solution C 100μL，置冰避光下靜置10 min。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞PI。采用鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白-V（calcium dependent phospholipid binding protein Annexin V，Annexin V）-碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，上機(jī)，測凋亡率。

PI＝（S＋G2M）/（G0/G1＋S＋G2M）×100%

2.5 檢測腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路相關(guān)基因表達(dá)取腫瘤組織1mm3研磨勻漿，采用Trizol試劑盒提取總RNA，模板為六聚體引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，對PI3K mRNA、Akt mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Caspase3 mRNA檢測。PI3K上游引物：5′-ATCGCTAGAGCTAGAGCTAGCTAG-3′，下游引物：5′-TCGATAGCTATATTAAGCGAGAGA-3′，片段長度312 bp；Akt上游引物：5′-TCGATAGCTAAGCTATAGCTAGAT-3′，下 游 引 物：5′-AGCCGCGAGAGCTAGAGATTTAG-3′，片段長度326 bp；Bcl-2上 游 引 物：5′-TCGCTCTCGCTATAGCTAGACTAG-3′，下游引物：5′-TCGCTCGAGTATGTAGCTAGTCAA-3′，片段長度410 bp；Bax上游引物：5′-TCGCGCTAGAGAGCTAGAGCTAG-3′，下游引物：5′-ACAAACCAAACGCGCGGAGAGA-3′，片段長度308 bp；Caspase3上游引物：5′-TCGATATATGTTTTGTTGTTGTCGC-3′，下 游 引 物：5′-CGCTCGCTCGCGAGAGCTAGAGC-3′，片段長度308 bp；β-actin上游引物：5′-TGAGATCGAGAGAGCTCTTCTCGC-3′，下游引物：5′-CGCGCTCGAGAGCTAGAGGCTCGA-3′，片段長度300 bp。反應(yīng)條件：94℃（3 min）、94℃（1 min）、55℃（1 min），共30個(gè)循環(huán)，最后72℃（1 min）。對產(chǎn)物電泳，Image-Pro PLUS圖像分析軟件分析，目的基因的相對表達(dá)量用2-△△Ct表示。

2.6 檢測腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路相關(guān)蛋白表達(dá)取腫瘤組織1 mm3剪碎、勻漿、研磨后加裂解液，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液采用BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白定量，轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗，4℃過夜孵育；加入二抗，室溫孵育2 h；洗膜，發(fā)光液處理；曝光、顯影和定影。分析計(jì)算目的蛋白表達(dá)，其中內(nèi)參為β-actin。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布且方差齊，其中多組間比較采用單因素方差分析，兩組間對比以SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對裸鼠的腫瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響共49只裸鼠建模成功，模型組9只，其余各10只，灌胃治療期間香砂六君子湯高劑量組有1只裸鼠由于操作不甚刺破食管死亡。與模型組比較，香砂六君子湯中、高劑量組及陽性組裸鼠的腫瘤質(zhì)量極顯著降低，抑瘤率極顯著升高（P＜0.01）；與陽性組比較，香砂六君子湯高劑量組裸鼠的腫瘤質(zhì)量顯著降低，抑瘤率極顯著升高（P＜0.01）。見表1。

表1 干預(yù)后各組腫瘤質(zhì)量和抑瘤率對比（±s）

表1 干預(yù)后各組腫瘤質(zhì)量和抑瘤率對比（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性組比較，＃＃P＜0.01

/%模型組組別 n腫瘤質(zhì)量（m/g） 抑瘤率9 1.58±0.20 0陽性組 10 0.75±0.15** 52.53±9.17**香砂六君子湯低劑量組10 1.02±0.17 35.44±4.01香砂六君子湯中劑量組10 0.74±0.16** 53.16±9.62**香砂六君子湯高劑量組9 0.50±0.09**＃＃68.35±11.33**＃＃

3.2 裸鼠腫瘤組織病理學(xué)變化模型組裸鼠腫瘤組織結(jié)腸腺體排列紊亂，幾乎無杯狀細(xì)胞，細(xì)胞層次紊亂且擁擠，大量炎癥細(xì)胞浸潤；香砂六君子湯低劑量組裸鼠腫瘤組織結(jié)腸腺體紊亂排列，少量杯狀細(xì)胞，細(xì)胞層次紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤；香砂六君子湯中劑量組和陽性組裸鼠腫瘤組織部分結(jié)腸腺體紊亂排列，有杯狀細(xì)胞，部分細(xì)胞層次紊亂，有部分炎癥細(xì)胞浸潤；香砂六君子湯高劑量組裸鼠腫瘤組織結(jié)腸腺體形態(tài)輕度不規(guī)則，有部分杯狀細(xì)胞，細(xì)胞層次清晰，少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組腫瘤組織病理學(xué)變化觀察（HE染色，×400）

3.3 對裸鼠腫瘤細(xì)胞PI、凋亡率的影響與模型組比較，香砂六君子湯低、中、高劑量組及陽性組裸鼠腫瘤細(xì)胞PI、凋亡率極顯著升高（P＜0.01）；與陽性組比較，香砂六君子湯高劑量組裸鼠腫瘤細(xì)胞PI、凋亡率極顯著升高（P＜0.01）。見表2、圖2-圖3。

圖2 各組細(xì)胞PI檢測圖（流式細(xì)胞儀檢測）

圖3 各組裸鼠腫瘤細(xì)胞流式圖

表2 各組細(xì)胞PI、凋亡率對比 （±s）

表2 各組細(xì)胞PI、凋亡率對比 （±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與陽性組比較，＃＃P＜0.01

組別 n PI/% 凋亡率/%模型組3 5.69±0.15 3.53±0.58陽性組 3 32.86±5.89**28.80±4.15**香砂六君子湯低劑量組3 22.43±4.15**18.97±3.12**香砂六君子湯中劑量組3 33.07±6.15**28.56±4.07**香砂六君子湯高劑量組3 42.88±7.10**＃＃45.37±5.88**＃＃

3.4 對裸鼠腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路相關(guān)基因表達(dá)的影響各組腫瘤組織PI3K mRNA、Akt mRNA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，香砂六君子湯低、中、高劑量組及陽性組裸鼠腫瘤組織Caspase3 mRNA、Bax mRNA水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性組比較，香砂六君子湯高劑量組Bcl-2 mRNA水平顯著降低，Bax mRNA、Caspase3 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路相關(guān)基因表達(dá)對比 （±s）

表3 各組腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路相關(guān)基因表達(dá)對比 （±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性組比較，＃P＜0.05

mRNA模型組 8 0.68±0.15 0.77±0.14 1.15±0.20 0.42±0.08組別 n PI3K mRNA Akt mRNA Bcl-2 mRNA Bax mRNA Caspase3 0.56±0.11陽性組 10 0.70±0.14 0.75±0.17 0.72±0.14** 0.72±0.14** 0.78±0.12**香砂六君子湯低劑量組 10 0.72±0.16 0.79±0.18 0.93±0.17* 0.59±0.10* 0.62±0.10*香砂六君子湯中劑量組 10 0.71±0.15 0.78±0.17 0.75±0.15** 0.74±0.13** 0.76±0.12**香砂六君子湯高劑量組 9 0.68±0.16 0.76±0.19 0.50±0.09**＃ 0.96±0.15**＃ 0.89±0.14**＃

3.5 對裸鼠腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與模型組比較，香砂六君子湯低、中、高劑量組及陽性組裸鼠腫瘤組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、Cleaved-Capase3/Capase3水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性組比較，香砂六君子湯高劑量組裸鼠腫瘤組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、Cleaved-Capase3/Capase3水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表4、圖4。

圖4 各組裸鼠腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

表4 各組腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路蛋白相對表達(dá)量對比 （±s）

表4 各組腫瘤組織PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路蛋白相對表達(dá)量對比 （±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與陽性組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

pase3/Capase3模型組組別 n p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt Bcl-2/Bax Cleaved-Ca 3 1.23±0.22 1.05±0.13 5.60±1.18 1.50±0.24陽性組 3 0.61±0.10** 0.52±0.08** 0.73±0.15** 1.37±0.20*香砂六君子湯低劑量組 3 0.98±0.17** 0.69±0.09** 1.94±0.17** 0.89±0.17**香砂六君子湯中劑量組 3 0.60±0.09** 0.50±0.07** 0.68±0.14** 1.35±0.21**香砂六君子湯高劑量組 3 0.19±0.04**＃＃ 0.23±0.04**＃＃ 0.08±0.02**＃＃ 1.44±0.23*＃

4 討論

結(jié)腸癌是多種病因共同作用的結(jié)果，包括遺傳因素、致癌物質(zhì)接觸及飲食習(xí)慣等，對于無法手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者常規(guī)治療常不能達(dá)到理想的成效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)腸癌可歸屬于“腸覃”“腸癖”“下痢”等范疇，多由外感淫邪、營衛(wèi)阻滯、濕熱邪毒蘊(yùn)結(jié)、勞逸失度等所致，使得腸道氣血運(yùn)行不暢，濕邪瘀血留滯，再加上嗜食肥甘厚膩，不潔之品，導(dǎo)致火毒瘀滯，傷及脾胃，運(yùn)化失職，宿食停滯，久而久之，濕濁內(nèi)生，化為郁火，熱毒客于腸道［9-10］。正氣虧虛，脾腎不足，氣血虧虛，腸道蠕動(dòng)減慢，傳導(dǎo)失職，加之飲食不節(jié)，外感淫邪，濕毒流注下焦，傷及腸道，五臟六腑皆受損，氣血阻滯，日久內(nèi)結(jié)成塊，生成癌毒［11-12］。因此，本病乃本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之癥，中醫(yī)常以養(yǎng)胃健脾、通下焦、去濕熱、暢達(dá)氣血等為治療原則。

香砂六君子湯主治脾胃氣虛、脘腹脹痛等，由六君子湯加砂仁、木香組成。該方以人參、茯苓、白術(shù)為君藥，兼具養(yǎng)胃健脾、益氣補(bǔ)中、祛邪扶正，重在治本；以半夏、陳皮、砂仁、木香寬中理氣、通下焦、燥濕熱，重在除標(biāo)；以甘草調(diào)和藥性，確保用藥安全。本研究發(fā)現(xiàn)，陽性組和香砂六君子湯低、中、高劑量組腫瘤質(zhì)量均顯著低于模型組，腫瘤組織均有明顯變性、壞死表現(xiàn)，且腫瘤組織PI和凋亡率均高于模型組，提示奧沙利鉑和香砂六君子湯具有抑制結(jié)腸癌荷瘤裸鼠腫瘤生長的作用，其中香砂六君子湯高劑量組作用優(yōu)于陽性組?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參、白術(shù)提取物的有效成分均可抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡［13-14］；茯苓可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，有助于抑制惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，增強(qiáng)其抗腫瘤作用［15］。金鐸等［16］對胃癌細(xì)胞株SGC-7901分別予以不同濃度加味香砂六君子湯和5-氟尿嘧啶發(fā)現(xiàn)，加味香砂六君子湯可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，主要是通過將細(xì)胞周期阻滯于G2期實(shí)現(xiàn)的，且高濃度加味香砂六君子湯的作用顯著優(yōu)于陽性對照藥物。楊君等［17］證實(shí)加味香砂六君子湯可抑制胃癌細(xì)胞株SGC790增殖；香砂六君子湯在結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后應(yīng)用有輔助抗腫瘤作用［18］。

PI3K/Akt是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵通路。PI3K屬于一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性，被激活后可增加p-PI3K水平，使得在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，而后者可與細(xì)胞內(nèi)含有pH結(jié)構(gòu)域的蛋白Akt結(jié)合，使Akt活化，增加p-Akt，激活核糖體激酶，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、存活和侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW116予以處理可下調(diào)p-PI3K、p-Akt水平，細(xì)胞增殖活性也隨之下降［19］。通過基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)證實(shí)PI3K/Akt是結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)［20］。目前國內(nèi)外均有眾多學(xué)者致力于PI3K抑制劑抗腫瘤的研究［21-24］。本研究推測香砂六君子湯可能是通過調(diào)控PI3K/Akt通路實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長和細(xì)胞增殖的作用的。

Bcl-2/Bax是經(jīng)典的細(xì)胞凋亡信號調(diào)控通路。Bcl-2是目前細(xì)胞凋亡研究中最受關(guān)注的癌基因之一，也是Bcl-2家族重要的成員，其編碼的蛋白多分布在線粒體外膜和細(xì)胞膜內(nèi)表面，具有抗凋亡作用，在結(jié)腸癌、直腸癌等惡性腫瘤組織中蛋白高表達(dá)。Bax的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2對細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡。Capase3具有拮抗Bcl-2的作用，誘導(dǎo)Capase3蛋白活化，Cleaved-Capase3水平升高，發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用［25］。Bcl-2、Bax、Capase3是目前認(rèn)為與細(xì)胞線粒體凋亡途徑密切相關(guān)的因素，抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax、Capase3表達(dá)，增加Cleaved-Capase3水平是抑制惡性腫瘤生長的有效手段［26-27］。敲除肝癌細(xì)胞共激活因子相關(guān)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（coactivator-associated arginine methyltransferase1，CARM1）可下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，增強(qiáng)Capase-3的活性，抑制肝癌細(xì)胞生長［28］。關(guān)于Bcl-2/Bax通路參與胃癌發(fā)生和發(fā)展的報(bào)道也較多，新型硫色滿酮衍生物可調(diào)控該通路抑制胃癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡［29］；在抗結(jié)腸癌的過程中Bcl-2表達(dá)下降，而Bax、Capase3表達(dá)升高［30］。本研究中陽性組和香砂六君子湯劑量組Bcl-2/Bax、Cleaved-Capase3/Capase3均下降，且香砂六君子湯的作用呈劑量依賴性。

綜上所述，香砂六君子湯可有效抑制結(jié)腸癌荷瘤裸鼠腫瘤生長，但高劑量藥物較奧沙利鉑表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)組織變性和細(xì)胞凋亡，可能是通過調(diào)控PI3K/Akt、Bcl-2/Bax通路實(shí)現(xiàn)的。