王藝臻，王佳林，朱西杰

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院，寧夏 銀川 750004

胃癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）指在慢性萎縮性胃炎基礎(chǔ)上伴腸上皮化生和異常增生的疾病，是正常胃黏膜向胃癌逐步轉(zhuǎn)化的過程，具有臨床表現(xiàn)不典型、發(fā)病不明顯、病程遷延難愈等特點［1］。研究發(fā)現(xiàn)，PLGC的發(fā)生與飲酒、喜食腌制食物、飲食不規(guī)則、喜食油煎食物、喜食辛辣食物、幽門螺桿菌感染、消化道腫瘤家族史、焦慮、抑郁等危險因素密切相關(guān)［2］。研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路在胃癌細胞中出現(xiàn)異?；罨．?dāng)腫瘤細胞的生存環(huán)境有壓力時，該通路被激活，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、凋亡、遷移、血管生成和周期運行［3］。因此，PI3K/AKT/mTOR信號通路被認為是在外環(huán)境壓力下細胞生存的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素［4］。本研究將通過單功能烷化劑甲基硝基亞硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）配合饑飽失常及情緒刺激綜合因素誘導(dǎo)大鼠PLGC模型，觀察復(fù)方蜥蜴散凝膠對大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響，為中醫(yī)藥治療PLGC提供新思路。

1 材料

1.1 動物SPF級健康雄性SD大鼠120只，許可證號：SCXK（寧）2015-0001，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房，16 h/8 h：光照/黑夜循環(huán)，溫度（22±2）℃，濕度45%～50%，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑復(fù)方蜥蜴散凝膠（由寧夏密點麻蜥15 g，黃芪30 g，黨參15 g，山藥15 g，白術(shù)15 g，元胡10 g，枳殼15 g，砂仁10 g，旋覆花10 g，佛手10 g，白芍15 g，烏梅10 g，半夏10 g組成，由寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)消化病研究所提供）；維酶素（樂普恒久遠藥業(yè)有限公司，批號：H41024448）。MNNG（日本東京化成工業(yè)株式會社，批號：8WF3NLC））；磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）抗體（北京博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-0128R）；AKT抗體（北京博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-0115R）；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）（北京博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-1992R）；BCA蛋白定量試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：KGPBCA）；TBST（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨 號：p25133）；ECL發(fā) 光 液（南 京 凱 基，貨 號：KGP1127）；PVDF膜（Millipore公 司，貨 號：IPVH00010）；蛋白marker（美國Thermo公司，貨號：26616）；Tris（日本Biofount公司，貨號：SS1426）。

1.3 儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱（南京實驗儀器廠，型號：HH.B11.600）；冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：centrifuge5417R）；光鏡（日本Olympus公司，型號：CKX41）；旋渦混合器（美國SI公司，型號：SI-0246）；切片機（德國Leica公司，型號：RM2016）；電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號：1658033）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號：XR＋）。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備將健康SPF級SD雄性大鼠120只，隨機分為6組，即空白組、模型組、維酶素組、復(fù)方蜥蜴散凝膠（高、中、低劑量）組，每組20只。除空白組外，其余各組大鼠連續(xù)24周灌胃0.02 mol·L-1MNNG溶液（5 g·kg-1）及加入等濃度的MNNG溶液自由飲用，輔助采取2日飽食、1日饑餓的饑飽失常法，飽食日自由飲食，饑餓日禁食不禁水，配合情緒刺激復(fù)制PLGC模型［5-7］，空白組大鼠給予同體積蒸餾水飲用。

2.2 模型鑒定及給藥除空白組外，其余組隨機抽取3只大鼠，殺檢，取病變胃黏膜，進行HE染色。若殺檢大鼠胃黏膜出現(xiàn)炎性細胞浸潤，杯狀細胞增多，腺體減少、萎縮及排列不規(guī)則等病理變化，則為PLGC模型復(fù)制成功。

復(fù)方蜥蜴散凝膠高、中、低劑量組分別以28 g·kg-1、14 g·kg-1、7 g·kg-1灌胃，維酶素組以7 g·kg-1灌胃，空白組和模型組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥12周。

2.3 HE染色觀察大鼠胃組織病理變化每組隨機選取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 g·kg-1），將其麻醉處死后，剖腹，在距賁門和幽門1.5 cm處分離出全胃，沿胃大彎側(cè)切開，生理鹽水沖洗，濾紙吸干鋪開，肉眼觀察胃黏膜的色澤形態(tài)、有無糜爛出血及增生等，然后從胃底處取2 cm×3 mm縱切條狀組織，置于40 ng·L-1多聚甲醛固定24 h，梯度脫水后，石蠟包埋，對其進行脫蠟：用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟各10 min；入水：乙醇100%乙醇Ⅰ和Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇各5 min→自來水沖洗5 min→蘇木素染色10 min→自來水沖洗30 min→鹽酸乙醇分化15 s→自來水沖洗30 min→伊紅染色5～8 min；過水；脫水：70%乙醇1 min→80%乙醇1 min→90%乙醇5 min→95%乙醇5 min→100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各5 min；透化：二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10 min；中性樹脂封片；顯微鏡下觀察大鼠胃組織病理變化［8-10］。

2.4 Western Blot法檢測大鼠胃組織PI3K、AKT、m TOR蛋白表達 每組選取6只大鼠的胃組織，將病變胃組織胃體部剪碎，加入裂解液30 min后，4℃，13 000 rpm·min-1離心5 min，吸取上清，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，取總蛋白沸水浴加熱變性后，取25μL上樣緩沖液，SDS-PAGE凝膠電泳；蛋白電泳分離后移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；置一抗稀釋液中，4℃過夜；洗滌3次，置二抗稀釋液中，室溫孵育1 h；顯色，以β-actin蛋白表達為參照，Image-proplus（Version 4.1）系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，圖像分析系統(tǒng)的光密度值為條帶灰度密度值和相應(yīng)的β-actin灰度密度值的比值作為指標進行結(jié)果分析［11］。實驗重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料采用均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。假設(shè)檢驗采用雙側(cè)檢驗，取α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠一般行為的影響除空白組，模型組大鼠出現(xiàn)大便不成形、精神狀態(tài)萎靡、扎堆少動、毛色晦暗無澤；復(fù)方蜥蜴散凝膠高、中、低劑量組及維酶素組大鼠的糞便成顆粒狀、精神狀態(tài)佳、活躍、毛色光潔。

3.2 對大鼠胃組織病理變化的影響空白組大鼠胃黏膜表面光滑平整，腺體結(jié)構(gòu)完整清晰可見，排列整齊，細胞形態(tài)正常，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜組織及腺體萎縮，細胞形態(tài)改變，杯狀細胞增多，大量炎性細胞浸潤，排列紊亂不規(guī)則；復(fù)方蜥蜴散凝膠高、中、低劑量組及維酶素組大鼠胃黏膜組織病理表現(xiàn)有痊愈趨勢，腺體增多，排列規(guī)則，炎性細胞及杯狀細胞浸潤減少，其中以復(fù)方蜥蜴散凝膠高劑量組最為明顯。見圖1。

圖1 大鼠胃組織病理學(xué)變化（HE染色，×200）

3.3 對大鼠胃組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠胃組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方蜥蜴散凝膠高、中、低劑量組及維酶素組大鼠胃組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 對大鼠胃組織PI3K、AKT、m TOR蛋白表達的影響

4 討論

PLGC的發(fā)生、發(fā)展過程中，脾胃虛弱貫穿于其病程的始末［12］。脾胃為后天之本、氣血生化之源，與機體的正氣盛衰和抗病能力密切相關(guān)。MNNG溶液作為外來邪氣侵襲，當(dāng)受到饑飽及情緒失常等因素刺激時，可致大鼠脾胃虛弱，加之失于調(diào)養(yǎng)，致脾胃不能腐熟水谷，通降功能失常，出現(xiàn)食入不化，胃氣上逆，嘔吐清水并夾雜不消化食物，最終導(dǎo)致氣血生化乏源，出現(xiàn)形體枯槁，生理功能失常等一系列病理變［13］。此外，中氣虧虛、氣虛不足以行血，則血行遲緩，逐漸壅滯成瘀，瘀血日久致各種毒素產(chǎn)物堆積。胃腸道動力的異常，黏膜失養(yǎng)而致其增生等，從而誘導(dǎo)PLGC的發(fā)生［14］。采用寧夏本土道地藥材密點麻蜥為主要藥物組成的復(fù)方蜥蜴散凝膠，有益氣養(yǎng)血、化瘀解毒之功效，可起到抗癌、抑癌、阻癌的治療效果。研究表明，寧夏密點麻蜥對胃腸道有親和力和靶向作用，可修復(fù)甚至逆轉(zhuǎn)胃腸道損傷的黏膜［15］，治療PLGC臨床效果顯著。以凝膠為給藥形式，使藥物能夠很好地黏附在胃黏膜上，形成保護膜，促進黏膜修復(fù)，創(chuàng)新蜥蜴散劑的給藥形式［16］。

研究表明，P13K/AKT/mTOR信號通路與細胞增殖關(guān)系密切，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17］，在細胞的生理病理活動過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR信號通路在胃癌細胞中出現(xiàn)異?；罨?，上游信號刺激時，PI3K活化，激活A(yù)KT，活化的AKT可直接激活mTOR，使其發(fā)生磷酸化，參與調(diào)控生物大分子如蛋白質(zhì)、核苷酸、脂質(zhì)等的合成過程，為腫瘤細胞生長提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)［19-20］。PI3K蛋白是信號通路的重要組成分子，是一種在腫瘤細胞質(zhì)與細胞核陽性表達的復(fù)合體，可參與細胞遷移等，還可調(diào)控腫瘤細胞的糖酵解過程［21-22］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，對腫瘤細胞的存活及凋亡起到重要作用。AKT能促進葡萄糖轉(zhuǎn)運子的膜轉(zhuǎn)位，增加葡萄糖攝取，促進糖酵解［23-24］。mTOR是細胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)因子，為PI3K/AKT/mTOR信號通路中下游的重要激酶之一，參與腫瘤細胞存活、增殖、侵襲與遷移等。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR蛋白在癌腫細胞的細胞核中過度活化，通過調(diào)節(jié)核苷酸、葡萄糖等生物小分子的攝取，改變mTOR信號中某些關(guān)鍵代謝酶的結(jié)構(gòu)，影響癌腫組織的生長及代謝［25-27］。PI3K/AKT通過激活下游靶點mTOR，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，促進腫瘤細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，進而降解、破壞細胞外基質(zhì)，使腫瘤細胞脫離原發(fā)部位而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［28］。P13K/AKT/mTOR信號通路不但參與調(diào)控腫瘤細胞增殖與凋亡，還與血管生成密切相關(guān)。血管生成是腫瘤賴以生長、轉(zhuǎn)移并具有致死性的基礎(chǔ)［29］。

本實驗結(jié)果顯示，復(fù)方蜥蜴散凝膠高劑量組藥效明顯優(yōu)于其他組，可有效緩解PLGC模型大鼠的癥狀，其作用機制可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)，通過調(diào)控此通路，干預(yù)細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善黏膜外環(huán)境，以平衡胃黏膜細胞異常增殖凋亡，防止細胞過度增殖分化，使機體處于“陰平陽秘”，三焦氣化功能正常，提高機體抗邪能力，為胃黏膜組織細胞功能的恢復(fù)提供有利環(huán)境［30］，從而阻斷PLGC的發(fā)生。