楊海峰，薄高峰，于興旺，李安玉，張 鑫，郝 璞，劉 璐

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子是一類植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，其有多種生物功能且廣泛分布于陸生植物中。在NAC蛋白質(zhì)N端的結(jié)構(gòu)域是高度保守和特異的[1]。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，主要涉及參與植物的生長發(fā)育調(diào)控、植物的逆境脅迫應(yīng)答、調(diào)控植物的抗病性、植物次生生長調(diào)控以及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。在植物不同發(fā)育時期和多種環(huán)境因素誘導(dǎo)下，激活特定目的蛋白，發(fā)揮著各種重要的生物學(xué)功能[2]。

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是至今發(fā)現(xiàn)的植物基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[3]。E.Soueretal[4]在矮牽牛(Petuniahybrida)中克隆出了NAC轉(zhuǎn)錄因子基因NAM(no apical meristem)。隨后在矮牽牛和擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)了ATAF1/2和CUC2這2個轉(zhuǎn)錄因子。并以其首字母命名為NAC結(jié)構(gòu)域[5]。NAC基因目前已在擬南芥、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、棉花(Gossypiumspp.)、沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)、蘋果(Malusdomestica)、小黑楊(Populus×xiaohei)、檉柳(Tamarixchinensis)等多種植物中獲得，但木本植物中研究并不深入。其中以楊樹為研究對象，對NAC家族進(jìn)行了系統(tǒng)分析，共鑒定出163個NAC基因家族成員，進(jìn)化分析顯示這些基因被聚類成18個亞家族[6]。通過從小黑楊中克隆獲得的NAC7基因并分析得出NAC7基因?qū)Ω啕}脅迫具有應(yīng)答反應(yīng)，基因主要在根中具有鹽脅迫應(yīng)答效應(yīng)[7]。蘇柳(Salix×jiangsuensis‘J2345’)中也成功克隆NAC基因，并推測柳樹SlNAC1基因在非生物脅迫下表達(dá)較為穩(wěn)定,受ABA和GA脅迫誘導(dǎo)[8]。

沙柳(Salixpsammophila)是中旱生落葉灌木，內(nèi)蒙古西北地區(qū)主要防風(fēng)固沙樹種。具有根系發(fā)達(dá)、耐干旱、易成活、生長快等特點(diǎn)，適宜在沙區(qū)生長，有很好的固碳釋氧和防風(fēng)固沙作用[9]。目前已經(jīng)從分枝角度[10]、生理脅迫[11]等多個方向展開研究。本研究由沙柳中克隆獲得SpsNAC042基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，對SpsNAC042基因開展了組織特異性表達(dá)及逆境下的表達(dá)分析。本研究為沙柳NAC基因家族的挖掘及逆境分子調(diào)控機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)，為相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究提供重要理論依據(jù)，為進(jìn)一步獲得優(yōu)異抗逆種質(zhì)資源和種質(zhì)創(chuàng)新奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來自內(nèi)蒙古達(dá)拉特旗國家沙柳無性系種質(zhì)資源保存庫，選取長勢良好的1年生單一無性系沙柳枝條(無性系編號11～30)扦插至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃地。待成活后截取長勢良好、長約50 cm的幼苗，放入植物培養(yǎng)箱中水培，待長出10 cm嫩枝后提取RNA用于基因克隆。

選取沙柳(無性系11～30)生長良好的莖尖、莖、葉、花、幼葉，置于液氮中保存待用。將枝條水培至生根約5 cm，取根置于液氮中保存待用。取沙柳嫩枝放置在2 L三角瓶中。以20%聚乙二醇(PEG)6000干旱脅迫處理；250 mmol NaCl鹽脅迫處理；培養(yǎng)箱中進(jìn)行4℃水培冷處理；培養(yǎng)箱進(jìn)行40℃水培熱處理；培養(yǎng)箱進(jìn)行24℃水培對照組。溶液保持在1/2，光照14 h黑暗10 h，并在1、2、4、8、12 h和24 h處理后收集葉片，3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)3株，置于液氮中保存待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄 使用天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(DP441)提取總RNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取4 μg總RNA，以Trans Script All in one First strand cDNA Synthesis Supermix for qPCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于克隆基因。

1.2.2 基因克隆 以全株的cDNA為模板，NAC1-F、NAC2-R為引物，利用A8聚合酶(北京艾德萊2×A8 Fast HiFi PCR MasterMix)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收后連接克隆載體pEASY-Blunt zero CloningVector(全式金,北京)。選取陽性克隆菌斑，送至北京Thermo Fisher公司進(jìn)行測序。

1.2.3SpsNAC042基因生物信息學(xué)分析 通過 NCBI 的 ORF(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件分析NAC基因的開放閱讀框；利用Phytozome 11數(shù)據(jù)庫搜索同源核苷酸及氨基酸序列；ExPASy(http://web.expasy.org/protscale/)在線預(yù)測親水性和疏水性；ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測等電點(diǎn)、分子量；在線軟件NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。Singal P4.1預(yù)測信號肽，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)；T-COFFEE (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)進(jìn)行氨基酸多序列比對；MEME Suite(http://meme-suite.org/)進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)比對；利用軟件MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。

1.2.4 沙柳SpsNAC042基因RT-qPCR表達(dá)分析 利用Primer3根據(jù)克隆的CDS序列設(shè)計(jì)定量引物qN1-F(GCAACTGGACTAAGAACGAATC G)，qN1-R(ACGACCCAGTACTGGCCCTT)，保證其特異性。利用實(shí)時定量PCR(RT-qPCR)的方法，以UBQ為內(nèi)參基因，分析NAC042基因在沙柳不同組織中的表達(dá)量。用Thermo RNA試劑盒分別提取正常條件下生長沙柳的根、莖、葉、花、莖尖，幼葉等組織的RNA；提取不同時間點(diǎn)經(jīng)過干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫、高溫脅迫成熟葉片的RNA。將提取的RNA進(jìn)行cDNA第一鏈合成。采用 2-ΔΔCt法分析RT-qPCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpsNAC042基因克隆

提取沙柳全株的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計(jì)分析，提取的RNA質(zhì)量較好，可用于cDNA轉(zhuǎn)錄。以NAC1-F、NAC1-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與目標(biāo)條帶900 bp一致(圖1)。經(jīng)Thermo Fishe公司測序，確定克隆獲得900 bp的目標(biāo)基因CDS序列(圖2)。

圖2 SpsNAC042基因CDS及蛋白序列Fig.2 SpsNAC042 gene CDS and protein sequence

2.2 目標(biāo)序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白理化特性分析 擴(kuò)增得到完整的CDS序列，長900 bp，編碼299個氨基酸。利用ExPASy-ProtPaRamtool軟件在線分析SpsNAC042氨基酸序列的理化性質(zhì)。測定蛋白親水性，SpsNAC042理論等電點(diǎn)(PI)為6.45，分子量為34 190.99 ku，SpsNAC042基因蛋白質(zhì)分子式為C1521H2344N406O452S20，蛋白質(zhì)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)51.39，為不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 SpsNAC042蛋白親水性和跨膜區(qū)分析 利用ExPASy-ProtPaRamtool分析得到SpsNAC042蛋白在第42個氨基酸處，疏水性最強(qiáng)，最大值1.578，在第200個氨基酸處，親水性最強(qiáng)，最小值-2.444，總平均疏水指數(shù)(GRAVY)-0.460，蛋白質(zhì)親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，是親水性蛋白(圖3)。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)：36，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)：35。利用Pfam在線軟件分析，SpsNAC042只有1個蛋白結(jié)構(gòu)域NAM，氨基酸序列12～134為NAM結(jié)構(gòu)域。

圖3 蛋白親疏水性分析Fig.3 Distributing curve of hydropathy of the protein

2.2.3 SpsNAC042蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示，SpsNAC042主要包含結(jié)構(gòu)形式為α螺旋(alphahelix)占9.70%，延伸鏈(extendedstrand)占24.41%，無規(guī)則卷曲(randomcoil)占65.89%。3種結(jié)構(gòu)所占比列差異比較大，以無規(guī)則卷曲為主，α螺旋最小(圖4)。SpsNAC042基因的N端和C端以延伸鏈和無規(guī)則卷曲為主。三級結(jié)構(gòu)中全局模型質(zhì)量評估(GMQE)為0.36，覆蓋率48.72%(圖5)。通過SWISS-MODEL對SpsNAC042蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到的三級結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖4 SpsNAC042蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of SpsNAC042 protein

圖5 SpsNAC042蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Putative of SpsNAC042 protein tertiary structure

2.2.4 SpsNAC042蛋白同源序列分析及同源結(jié)構(gòu)域分析 將克隆獲得的SpsNAC042序列與歐洲紅皮柳SapurV1A.0284s0040.1、毛果楊Potri.007G065400.1、蘋果MDP0000298182、桃子Prupe.4G143600.1、擬南芥AT1G56010.2、水稻LOC_Os06g46270.1、玉米GRMZM2G063522_T01所編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析(圖6)。SpsNAC005與其他的氨基酸序列都具有1個典型的保守結(jié)構(gòu)域NAM，且均有A、B、C、D、E共5個氨基酸同源序列區(qū)域。同時N 端序列相對保守，而 C 端是高度多變的轉(zhuǎn)錄激活功能域，符合NAC基因家族的典型特征。上述結(jié)構(gòu)表明克隆所獲得的基因?qū)儆贜AC基因家族成員。

利用MEME Suite在線軟件，對SpsNAC042和同源基因進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ?圖6)，結(jié)構(gòu)域參數(shù)設(shè)定為12。結(jié)果表明SpsNAC042和對比植物均有保守結(jié)構(gòu)NAM，均具有A、B、C、D、E共5個保守亞結(jié)構(gòu)域，符合NAC基因家族的特征。其中柳科與楊樹科親緣關(guān)系相近，所分析的結(jié)構(gòu)域完全一致。這組對比基因的同源結(jié)構(gòu)相似度很高，推測SpsNAC042在進(jìn)化過程中，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

圖6 SpsNAC042基因家族氨基酸序列多重比對和同源結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ菷ig.6 Multiple alignment of amino acid sequences and comparison of homologous domains of SpsNAC042 gene family

2.2.5SpsNAC042系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將本研究克隆所得的SpsNAC042基因編碼的氨基酸序列與擬南芥、歐洲紅皮柳、毛果楊、717楊、蘋果、桃子、擬南芥、水稻、玉米同源基因，利用NJ算法進(jìn)行進(jìn)化樹分析(圖7)。結(jié)果表明，沙柳NAC042與歐洲紅皮柳、毛果楊及毛白楊科屬親緣關(guān)系相近的為同一進(jìn)化分支，木本植物與草本植物在不同進(jìn)化分支，預(yù)測NAC基因有可能在木本植物和草本植物中存在分化，與上述同源序列和同源結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致。

注：SapurV1A.0284s0040.1歐洲紅皮柳、Potri.007G065400.1毛果楊、JX534240.1 717楊、MDP0000298182蘋果、Prupe.4G143600.1桃子、AT1G56010.2擬南芥、LOC_Os06g46270.1水稻、GRMZM2G063522_T01玉米圖7 SpsNAC042基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 The neighbor-joinning tree of SpsNAC042 gene family

2.2.6 沙柳SpsNAC042基因的組織特異性定量分析 以沙柳7個不同組織部位為模板，通過中RT-qPCR檢測分析各組織部位的相對表達(dá)量(圖8)。以UBQ基因?yàn)閰⒄?，其中花中的基因相對表達(dá)量最高，幼葉、莖9～15節(jié)間根、葉的表達(dá)量依次降低，莖尖的表達(dá)量最低。

圖8 RT-qPCR分析SpsNAC042基因的組織特異性表達(dá)Fig.8 Tissue specific expression analysis of SpsNAC042 with RT-qPCR

2.2.7 沙柳SpsNAC042基因在逆境處理下定量表達(dá)分析 將沙柳在干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫、高溫脅迫進(jìn)行處理，利用RT-qPCR分析SpsNAC042基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，在干旱處理下SpsNAC042基因與對照組相比整體呈增長趨勢，并在8 h處達(dá)到最高；在低溫處理下，基因表達(dá)量迅速積累，在2 h處達(dá)到最高，然后維持在較低水平表達(dá)；(圖9A、9C)。在鹽和高溫處理下SpsNAC042基因緩慢積累，后期迅速增高，最終在24小時處達(dá)到最高(圖9B、9D)。

圖9 RT-qPCR分析SpsNAC042基因在不同逆境下的特異性表達(dá)Fig.9 Specific expression of SpsNAC042 gene under different stresses of RT-qPCR analysis

3 結(jié)論與討論

多序列及結(jié)構(gòu)域比對分析表明，SpsNAC042蛋白含有 1 個高度保守的典型NAM結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建表明SpsNAC042基因與歐洲紅皮柳和毛果楊同源基因的同源性較高。SpsNAC042基因在鹽脅迫和高溫脅迫下應(yīng)答較為明顯。在低溫和干旱脅迫下有應(yīng)答。該基因歸屬于SNAC(Stress-responsiveNAC)大類。

本研究以木本植物沙柳為材料，選取SpsNAC042轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行抗逆功能分析。M.Nuruzzamanetal[13]研究表明，20%～25%的NAC基因都至少與一種脅迫相關(guān)[13]。而干旱、高鹽、低溫、高溫是影響植物生長發(fā)育的主要逆境因子[14]。故本研究應(yīng)用熒光定量PCR法分析了SpsNAC042基因在干旱、高鹽、冷和高溫脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)NAC基因與多種非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。在有關(guān)香蕉(Musanana)的研究中表明，MusaNAC042在提高轉(zhuǎn)基因香蕉植株的耐鹽性和耐旱性方面的作用明顯，MusaNAC042的表達(dá)與鹽脅迫和干旱脅迫呈正相關(guān)[15]。在小黑楊的研究中表明NAC7轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)}脅迫具有應(yīng)答反應(yīng)[7]。上述研究與本研究結(jié)果相似，在本研究中干旱、低溫、高溫、鹽脅迫均能誘導(dǎo)SpsNAC042基因的表達(dá)，但在應(yīng)答快慢上有不同程度的差異。該結(jié)果表明沙柳NAC042基因?qū)γ{迫有所應(yīng)答，很有可能參與沙柳的抗逆調(diào)控。

根據(jù)同源序列分析，本研究由沙柳中克隆獲得SpsNAC042基因，進(jìn)化樹分析表明與草本植物擬南芥NAC1(AT1G56010)基因?yàn)橥椿騕16]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)NAC1轉(zhuǎn)錄因子可能參與外植體特異性傷口信號傳導(dǎo)途徑。在器官形成、再生、側(cè)根、不定根形成中發(fā)揮不同的作用[16]。有學(xué)者研究表明，與擬南芥NAC1為同源基因的葡萄VvNAC1基因在非生物脅迫下有積極作用，VvNAC1基因在發(fā)育中的花表達(dá)增強(qiáng)[17]。在本研究基因組織特異性表達(dá)與之相吻合。此外，研究人員還進(jìn)行了一系列的生物脅迫試驗(yàn)，并表示VvNAC1基因可能會觸發(fā)不同信號防御途徑的調(diào)節(jié)[17]。因?yàn)镹AC基因結(jié)構(gòu)域的C端是高度多變的轉(zhuǎn)錄激活功能域，可能導(dǎo)致不同調(diào)控功能。后續(xù)研究會補(bǔ)充該試驗(yàn)內(nèi)容。

根據(jù)基于擬南芥、水稻、石松和苔蘚中大部分NAC基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析研究，將功能相近的NAC基因各自歸類，其中脅迫響應(yīng)的NAC基因都?xì)w屬于SNAC(Sress-responsiveNAC)大類[18]。NAC轉(zhuǎn)錄因子中很多成員對非生物脅迫都具有應(yīng)答反應(yīng)，如柑橘在低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫條件下NAC83基因呈現(xiàn)出差異性的表達(dá)[19]。MdNAC1轉(zhuǎn)基因蘋果植株在干旱脅迫條件下，抗旱性明顯增強(qiáng)[20]。玉米ZmNAC62轉(zhuǎn)基因株系參與調(diào)控干旱，低溫脅迫[21]。AgNAC1對高溫，低溫，干旱和鹽脅迫均有響應(yīng)[22]。根據(jù)上述研究及本研究中SpsNAC042基因在逆境下的相應(yīng)，分析預(yù)測SpsNAC042基因應(yīng)該在沙柳遭遇生物或非生物脅迫時響應(yīng)表達(dá)，為正調(diào)節(jié)因子，隸屬SNAC大類。