王立 謝鵬 賀小武 季世偉 周建平

中國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū)［1］，>60%的胃癌患者在初診時(shí)已處于進(jìn)展期，預(yù)后較差［2］。為改善胃癌預(yù)后，現(xiàn)丞需尋找新的分子生物學(xué)標(biāo)志物，Holliday交叉識(shí)別蛋白（HJURP）位于人染色體的2q37.1上，長(zhǎng)約17.73kb，有9個(gè)外顯子、2529個(gè)核苷酸，編碼748個(gè)氨基酸［3］，是著絲粒蛋白A的分子伴侶（CENP-A），與CENP-A結(jié)合促進(jìn)CENP-A在核小體上的招募，輔助核小體裝配，若其功能不全，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［4］。已有研究報(bào)道，HJURP在乳腺癌、肝癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)［5-6］，但HJURP在胃腺癌中的高表達(dá)與預(yù)后并不相關(guān)［7］。本研究擬通過檢測(cè)HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理及預(yù)后的相關(guān)性，探討HJURP基因與胃癌之間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年1月至2016年12月本院普外科收治的胃癌患者79例，胃癌根治術(shù)前均未接受放、化療等治療。其中，男58例，女21例；年齡36～83歲，中位年齡66歲；腫瘤直徑≥5 cm者26例，腫瘤直徑<5 cm者53例（若腫塊為潰瘍型，以潰瘍最外側(cè)緣為界確定腫瘤直徑）；病理組織學(xué)類型，中高分化癌51例、低分化或未分化癌28例；胃壁浸潤(rùn)程度即胃壁侵犯深度，T1/T2 17例、T3/T4 62例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；TNM分期參照2018年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ/Ⅱ期30例、Ⅲ/Ⅳ期49例；術(shù)后病理證實(shí)脈管有癌栓者43例，無癌栓者36例；術(shù)前CEA≥5 ng/mL者63例，<5 ng/mL者16例；術(shù)后電話或門診隨訪，死亡44例，中位生存期39個(gè)月。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 收集79例胃癌患者的胃癌組織作為實(shí)驗(yàn)樣本，另隨機(jī)選取同期于本院就診的胃良性疾病患者27例，收集其正常胃組織（非癌樣本旁的正常胃組織）作為對(duì)照樣本。采用免疫組化二步法檢測(cè)正常胃部組織、胃癌組織中HJURP蛋白的表達(dá)。病理蠟塊連續(xù)切片，厚度3～5 μm，3片；將切片放入60 ℃烤箱烘烤2 h；二甲苯浸泡2次，進(jìn)行脫蠟，每次5 min；無水乙醇2次、95%乙醇1次、70%乙醇1次，進(jìn)行水化，每次3 min；然后，純水漂洗3 min，95 ℃預(yù)熱，0.01 M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）抗原修復(fù)20 min，加入3%過氧化氫甲醇溶液靜置10 min進(jìn)行阻斷，加入5%BSA封閉液室溫靜置20 min封閉，滴加HJURP一抗（1∶200）4 ℃過夜，滴加辣根酶標(biāo)記的兔二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后封片。實(shí)驗(yàn)中使用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為一抗的陰性對(duì)照，HJURP一抗和辣根酶標(biāo)記兔二抗均購(gòu)自AbCAM 公司。病理讀片、判斷分別由一位病理科主任醫(yī)師和一位病理科副主任醫(yī)師獨(dú)立完成。

1.3 觀察指標(biāo) HJURP在胃癌組織中的表達(dá)情況，病理判讀評(píng)分：染色范圍未著色為0分，<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分；染色強(qiáng)度評(píng)分范圍為0～3分；以染色強(qiáng)度評(píng)分與染色范圍評(píng)分的乘積作為最終評(píng)分，并據(jù)此將實(shí)驗(yàn)樣本分為陰性組（0～2分）和陽(yáng)性組（3～9分）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精準(zhǔn)；生存曲線采用Kaplan-Meier方法評(píng)估，并用log-rank檢驗(yàn)比較差異；構(gòu)建單因素、多因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型預(yù)測(cè)生存期。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達(dá) HJURP主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，見圖1。實(shí)驗(yàn)樣本中陽(yáng)性表達(dá)33例（41.8%），正常胃組織中陽(yáng)性表達(dá)5例（18.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037）。

圖1 HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達(dá)（免疫組化染色）

2.2 HJURP表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組的臨床病理資料比較 HJURP的表達(dá)水平與胃癌組織的淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管有無癌栓有相關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡、術(shù)前CEA、腫瘤大小、分化程度、胃壁侵潤(rùn)深度無關(guān)（P>0.05）。見表1。

表1 HJURP表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組的臨床病理資料比較

2.3 生存分析 79例胃癌患者的總體中位生存時(shí)間為56個(gè)月（95%CI：31.856-80.144），其中HJURP高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為36個(gè)月（95%CI：23.313-48.687），顯著低于HJURP低表達(dá)患者，log-rank檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，見圖2。單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，腫瘤的胃壁浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移及TMN分期、HJURP表達(dá)與生存期相關(guān)，可能是胃癌的臨床預(yù)后因子。進(jìn)一步校正，納入單因素回歸分析中P<0.05的因素進(jìn)行多因素Cox回歸，結(jié)果提示HJURP表達(dá)水平與腫瘤TNM分期等因素可以作為胃癌的預(yù)后因子預(yù)測(cè)患者的OS。見表2。

圖2 HJURP表達(dá)對(duì)胃癌患者生存期影響的Kaplan-Meier曲線

表2 影響胃癌患者預(yù)后的單因素、多因素Cox回歸分析

3 討論

流行病學(xué)證據(jù)顯示，環(huán)境、飲食等因素在胃癌的發(fā)生過程中起重要作用［8］。胃癌發(fā)病在世界范圍內(nèi)存在較大的地理、人群分布差異，中國(guó)、日本、韓國(guó)為代表的東亞地區(qū)發(fā)病率及死亡率明顯高于北美、歐洲及非洲地區(qū)［9］。與發(fā)病率同樣高的日本、韓國(guó)相比，中國(guó)胃癌患者的5年相對(duì)生存率較低，可能是由于我國(guó)大多數(shù)胃癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，而胃癌的治療效果與首次診斷時(shí)間密切相關(guān)［10］。因此，積極發(fā)現(xiàn)新的分子生物學(xué)標(biāo)記物，有助于提高胃癌的早期診斷率，協(xié)助臨床診療，延長(zhǎng)我國(guó)胃癌患者的生存期。

HJURP于2007年由TATSUYA K等發(fā)現(xiàn)，是毛細(xì)血管擴(kuò)增性共濟(jì)失調(diào)突變（ATM）通路的下游靶基因，DNA雙鏈斷裂（DBS）可以引起HJURP的表達(dá)增加，DNA損傷后HJURP參與DSB損傷修復(fù)過程中的同源重組，而DNA修復(fù)途徑中的重要成分表達(dá)異常往往會(huì)增加基因突變和腫瘤發(fā)生的機(jī)會(huì)。當(dāng)HJURP表達(dá)被抑制，細(xì)胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)異常的染色體融合，引起基因的不穩(wěn)定性，因此認(rèn)為HJURP是維持染色體穩(wěn)定的一個(gè)不可或缺的因素［5］。FOLTZ等［11］研究發(fā)現(xiàn)在著絲粒染色質(zhì)裝配過程中，HJURP是CENP-A的特異性分子伴侶。CENP-A是組蛋白H3的變異體，維持著絲粒定位并影響著絲粒的形成，對(duì)高保真染色體分離至關(guān)重要，而著絲粒的功能異?？蓪?dǎo)致染色體的異常分離，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生［12-13］。近年來，HJURP表達(dá)與惡性腫瘤的相關(guān)研究陸續(xù)出現(xiàn)，眾多研究提示HJURP表達(dá)異?？赡芘c腫瘤的發(fā)生與預(yù)后相關(guān)。KATO等［5］發(fā)現(xiàn)HJURP通過參與DSB過程，參與維持染色體的穩(wěn)定及細(xì)胞永生，并觀察到HJURP表達(dá)異常與肺癌的不良預(yù)后相關(guān)。HU等［3］發(fā)現(xiàn)HJURP在肝細(xì)胞肝癌（HCC）組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且其高表達(dá)是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。遲鋮［7］研究發(fā)現(xiàn)，HJURP在胃腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，此種差異性表達(dá)與總體生存率無差別，但在未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃腺癌患者中，HJURP高表達(dá)的胃腺癌患者總生存期明顯高于HJURP低表達(dá)的胃腺癌患者。

本研究對(duì)胃癌組織和正常胃組織的病理切片進(jìn)行免疫組化染色，探討HJURP與胃癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中HJURP的表達(dá)明顯高于正常胃組織，進(jìn)一步結(jié)合實(shí)驗(yàn)樣本的臨床病理特征進(jìn)行分析，結(jié)果提示HJURP的表達(dá)可能與胃癌組織的淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管有無癌栓相關(guān)，而與性別、年齡、術(shù)前CEA、腫瘤大小、分化程度、胃壁侵潤(rùn)深度無關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HJURP基因的高表達(dá)往往與患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示HJURP表達(dá)可能是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，這與HU等［3，5］研究HJURP在肝癌等腫瘤中的表達(dá)結(jié)果一致，但與遲鋮［7］研究HJURP在胃腺癌中的表達(dá)結(jié)果相悖，此種差異是否與入組患者的疾病分期、病理分型等不同因素相關(guān)，仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上，HJURP未來可能會(huì)成為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，可通過檢測(cè)胃癌患者的HJURP表達(dá)，積極協(xié)助臨床診療以獲得更好的預(yù)后，甚至基于此分子基因靶點(diǎn)進(jìn)行胃癌靶向治療相關(guān)分子通路及藥物的探索，為胃癌的治療提供新思路。