孫奕凡 臧淑妃* 楊傳玉 汪麗紅
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是單純性脂肪肝(NAFLD)進(jìn)展為肝硬化的限速步驟[1-2]?;谖覈嫶蟮腘AFLD人群和較高的NASH發(fā)生率,對NASH患者進(jìn)行及時(shí)有效的干預(yù)具有重要意義。膽汁酸(BA)是由肝細(xì)胞以膽固醇為原料合成并分泌的具有兩性結(jié)構(gòu)的分子[3-4],膽汁酸代謝異常與NASH的進(jìn)展關(guān)系密切[5]。消膽胺(CHY)作為膽汁酸螯合劑,臨床上用于降低膽固醇,基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中用于去除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性膽汁酸[4,6],但其對代謝的影響尚不清楚。而法尼醇X受體(FXR)作為膽汁酸代謝關(guān)鍵分子,激活后可改善NASH炎癥和纖維化[7]。本研究擬采用課題組前期建立的ApoE-/-小鼠NASH模型予以CHY干預(yù),觀察其對FXR的影響以及防治NASH的作用,并探討其可能機(jī)制。
1.1 造模及分組 40只SPF級(jí)6周齡雄性ApoE-/-小鼠平均分為4組,對照(LFD)組給予低脂飲食(LFD,貨號(hào)98121701,品牌Research Diet,美國)喂養(yǎng),NASH模型(HFHC)組給予高脂高膽固醇飲食(HFHC,貨號(hào)D12079B,品牌Research Diet,美國)喂養(yǎng),CHY對照(LFD+CHY)組給予低脂飲食+2%CHY(貨號(hào)C4650,美國Sigma)喂養(yǎng),CHY干預(yù)(HFHC+CHY)組給予高脂高膽固醇飲食+2%CHY喂養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)12周。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)血液學(xué)指標(biāo)檢測:小鼠喂養(yǎng)12周后,采用戊巴比妥鈉麻醉,心臟取血800~900 μL后,頸椎脫位法處死,立即無菌獲取肝臟、腸道,液氮速凍并置于-80 ℃?zhèn)溆?。血液置?.5 mL離心管靜置2 h后,以3000 r/min離心15 min,取上清,使用日立7180全自動(dòng)生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)等指標(biāo)水平。(2)熒光定量RT-PCR:取腸道及肝臟組織約50 mg,采用TRIZOL/氯仿抽提法提取總RNA,抽提的RNA純度、濃度均到達(dá)質(zhì)控要求(濃度至少200 ng/μL,純度1.9~2.0)后,使用羅氏逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):32460620,品牌:Roche,德國)cDNA第一鏈合成系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以20 μL反應(yīng)體系使用SYBR Green mix(批號(hào):04913914001,品牌:Roche,德國)熒光定量,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)的相對水平。(3)油紅O染色:新鮮肝臟冰凍切片,厚度10 μm,10%多聚甲醛固定40 min,PBS清洗3次,每次10 min,再經(jīng)60%異丙醇漂洗30 s;采用新鮮現(xiàn)配6∶4油紅O染色液染色15~20 min,60%異丙醇清洗3次,每次10 s,蒸餾水清洗10 s,蘇木素復(fù)染核5 min,流水沖洗10 s,甘油明膠封片,光鏡下觀察拍照。(4)Western Blot:采用RIPA裂解法提取總蛋白,使用酶標(biāo)儀采用BCA法測定所提蛋白的濃度,之后根據(jù)蛋白濃度及上樣量,添加5X蛋白上樣緩沖液,99 ℃加熱10 min使蛋白變性,根據(jù)所測蛋白分子量配膠,40 ng蛋白量上樣,上層膠80 V 30 min+下層膠120 V 2 h電泳,10%牛奶封閉1 h后一抗4 ℃孵育過夜,TBST清洗3次,每次10 min,二抗室溫孵育1 h,TBST清洗3次,每次10 min,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集、分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s)表示,組間均數(shù)比較采用ANOVA單因素方差分析;組間兩兩比較,方差齊者采用LSD或SNK法,方差不齊者采用Tamhane或Dunnett法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組小鼠的體質(zhì)量、肝重及各項(xiàng)血清學(xué)生化指標(biāo)比較 見圖1。HFHC和LFD連續(xù)喂養(yǎng)12周后,HFHC組體重、肝體重比以及血清ALT、AST、TG、TC水平均明顯高于LFD組(P<0.05);與HFHC組相比,CHY+HFHC組小鼠的體重、肝體重比以及血清ALT、AST、TG、TC水平均顯著降低(P<0.05)。
圖1 A. 四組小鼠體質(zhì)量比較;B. 四組小鼠肝體重比較;C. 四組小鼠的血清ALT水平比較;D. 四組小鼠的血清AST水平比較;E. 四組小鼠的血清TG水平比較;F.四組小鼠的血清TC水平比較;***P<0.001;**P<0.01,*P<0.05
2.2 各組小鼠的肝組織病理學(xué)結(jié)果 油紅O染色結(jié)果顯示,LFD組小鼠無明顯脂肪變,HFHC組小鼠出現(xiàn)明顯脂肪變;予以CHY干預(yù)后,LFD+CHY組和HFHC+CHY組的油紅O染色面積、密度、染色程度均較對照組明顯降低,說明CHY干預(yù)能夠明顯減輕肝內(nèi)形成。見圖2。
圖2 各組小鼠的肝組織病理學(xué)結(jié)果
2.3 各組小鼠肝臟內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平比較 與 HFHC組比較,HFHC+CHY組小鼠的肝內(nèi)KC活化標(biāo)志分子CD68(P<0.001)、F4/80(P<0.001)和炎癥相關(guān) 分 子TNF-α(P<0.01)、MCP-1(P<0.001)、TLR4(P<0.05)的mRNA水平均顯著下降,見圖3 A-B。肝組織勻漿ELISA結(jié)果顯示,HFHC+CHY組小鼠肝內(nèi)TNF-α(P<0.01)、IL-1β(P<0.001)的表達(dá)水平均明顯下降,見圖3C。小鼠肝臟組織行IHC CD68與F4/80染色,結(jié)果顯示HFHC+CHY干預(yù)組的CD68和F4/80陽性灶明顯減少,說明CHY可改善HFHC誘導(dǎo)的KC活化,見圖4-5。
圖3 A-B. 各組小鼠肝內(nèi)CD68、F4/80、TNF-α、MCP-1及TLR4的mRNA水平比較;C. 各組小鼠肝臟炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平比較
圖4 各組小鼠肝臟組織CD68免疫組化結(jié)果(DAB×200)
2.4 各組小鼠肝臟內(nèi)FXR及SHP mRNA信號(hào)分子表達(dá)水平比較 與LFD對照組比較,NASH模型組小鼠肝內(nèi)FXR(P<0.001)、SHP(P<0.001)的表達(dá)均顯著下調(diào),經(jīng)CHY干預(yù)后,F(xiàn)XR(P<0.01)、SHP(P<0.01)的表達(dá)均顯著上調(diào),見圖6。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NASH模型組小鼠的肝內(nèi)FXR信號(hào)受損,F(xiàn)XR、SHP分子蛋白的表達(dá)顯著下降,經(jīng)CHY干預(yù)后發(fā)生明顯上調(diào),見圖7。
圖5 各組小鼠肝臟組織F4/80免疫組化結(jié)果(DAB×200)
圖6 各組小鼠肝臟FXR及相關(guān)分子SHP mRNA 的表達(dá)
圖7 各組小鼠肝內(nèi)FXR及SHP蛋白的表達(dá)水平
近年來,腸道菌群被認(rèn)為是NASH“多重打擊”中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[8]。飲食、藥物、內(nèi)源性激素等原因?qū)е碌木菏д{(diào)破壞腸道屏障功能,產(chǎn)生過度的內(nèi)毒素和PAMPs[9]通過通透性增加的腸道屏障,經(jīng)門靜脈循環(huán)到達(dá)肝臟,激活肝內(nèi)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng),可造成長期慢性的肝臟炎癥損傷。有證據(jù)顯示,NASH動(dòng)物模型經(jīng)CHY干預(yù)治療可明顯改變腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu),減少腸源性內(nèi)毒素和毒性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與吸收,修復(fù)腸道屏障功能,恢復(fù)腸道的通透性,從而達(dá)到改善NAFLD/NASH的作用。膽汁酸作為腸道菌群代謝物的一種,具有體內(nèi)FXR等受體的天然配體,其介導(dǎo)的生物學(xué)信號(hào),尤其是FXR信號(hào),可以通過抑制CYP7A1、CYP8B1兩種膽汁酸合成酶的表達(dá),從而負(fù)反饋調(diào)控膽汁酸的合成,在NASH的發(fā)展中起重要作用[10]。研究表明,敲除FXR可以破壞機(jī)體的糖脂代謝,促進(jìn)肝臟的脂肪變性及炎癥的進(jìn)展,應(yīng)用外源性FXR抑制或激動(dòng)劑、或是消除內(nèi)源性膽汁酸均可顯著改善NAFLD的進(jìn)展[11]。本研究試圖驗(yàn)證CHY干預(yù)與FXR信號(hào)表達(dá)的關(guān)系,并探究其與HFHC誘導(dǎo)的NASH是否相關(guān)。
本研究發(fā)現(xiàn),HFHC誘導(dǎo)12周的ApoE-/-小鼠出現(xiàn)明顯的肝臟脂肪性變與炎癥表現(xiàn),轉(zhuǎn)氨酶、血脂等血清學(xué)指標(biāo)和CD68、F4/80、TNF-α等炎癥因子水平表達(dá)均明顯升高,且與肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)一致。經(jīng)CHY干預(yù)后,HFHC模型小鼠的各項(xiàng)炎癥指標(biāo)均明顯改善,病理學(xué)結(jié)果亦證明CHY干預(yù)能夠減輕肝臟炎癥。CD68與F4/80是Kupffer細(xì)胞的標(biāo)志物,而Kupffer細(xì)胞募集和活化在NAFLD炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用[7,12],提示CHY對炎癥的改善作用可能與其對Kupffer細(xì)胞活化的抑制有關(guān)。另外,NASH模型小鼠出現(xiàn)肝內(nèi)FXR信號(hào)相關(guān)分子的顯著下調(diào),包括FXR、SHP。經(jīng)CHY干預(yù)后,NASH模型小鼠的FXR信號(hào)抑制狀態(tài)得到明顯改善,可能是CHY通過激活膽汁酸代謝過程中的FXR信號(hào),減輕KC細(xì)胞的活化,抑制了NASH的發(fā)生發(fā)展。
綜上,本研究證實(shí)CHY對NASH具有防治作用,為將CHY作為防治NASH的潛在藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。