熊安英，牛 斌，張 雷，熊 瑛，宋 琦，何 翔，李國平△

(1.國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床研究中心成都市第三人民醫(yī)院分中心/成都市呼吸健康研究所過敏與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，成都610031；2.四川省友誼醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，成都 610011；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，四川瀘州 646000)

特發(fā)性肺纖維化是最常見的間質(zhì)性肺病，具有侵襲性和致死性，5年生存率僅為20%[1-2]。該病好發(fā)于中老年男性，主要表現(xiàn)為干咳、進(jìn)行性加重的呼吸困難，伴限制性通氣功能障礙和氣體交換障礙，導(dǎo)致低氧血癥，患者最終因呼吸衰竭而死亡[3-4]。上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、血小板源性生長因子等，誘發(fā)肺纖維化的發(fā)生[5]。研究表明，TGF-β和Wnt信號通路在肺、肝、消化道等不同器官和系統(tǒng)的組織修復(fù)和重塑中發(fā)揮了重要作用[6]。多項(xiàng)研究也表明纖維化性肺疾病中TGF-β水平持續(xù)升高，可導(dǎo)致過度修復(fù)過程和器官功能障礙[7-8]，這為治療特發(fā)性肺纖維化增加了困難。目前，延緩特發(fā)性肺纖維化進(jìn)程的藥物主要以吡非尼酮和尼達(dá)尼布為主，不良反應(yīng)大且價(jià)格相當(dāng)昂貴，給患者造成了一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找一種安全有效且價(jià)格低廉的藥物在肺纖維化的防治過程中極為重要。

趕黃草又名扯根菜，是我國分布廣泛的一種天然草本植物。研究發(fā)現(xiàn)，趕黃草提取物對乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌具有保護(hù)作用[9]，同時(shí)對乙醇或氧化性導(dǎo)致的肝損傷具有保護(hù)作用[10]。ZHOU等[11]發(fā)現(xiàn)趕黃草提取物生松素能通過SIRT3-TGF-β-smad信號通路抑制肝星狀細(xì)胞的激活進(jìn)而抑制肝纖維化。目前尚未發(fā)現(xiàn)趕黃草治療肺纖維化的相關(guān)研究，在本課題組實(shí)驗(yàn)中，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TGF-β和Wnt4存在相互關(guān)系，因此，推測趕黃草可能通過抑制TGF-β和Wnt4相關(guān)信號抑制肺纖維化。本研究探討趕黃草對肺纖維化的作用及其機(jī)制，以期對趕黃草的研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞(上海中喬新舟生物科技有限公司)；趕黃草對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，DZYC-G-028)；RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒、RNA SuperMix試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(中國Vazyme公司)；最低基本培養(yǎng)基(minimum Eagle′s medium,MEM)、胎牛血清、Sodium pyruvate(美國Gibco公司)；MEM Nonessential Amino Acid Solution、丙酮酸鈉、CCK8(中國Solarbio公司)；TGF-β、Wnt4(美國Abcam公司)；纖連蛋白(fibronectin,FN1)、Ⅰ型膠原(中國Bioss公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(新加坡ESCO公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；激光共掃描顯微鏡(德國Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)收集

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Exppression Omnibus)中搜索TGF-β組(6個(gè)生物重復(fù)組)和對照組(5個(gè)生物重復(fù)組)相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異基因RNAs。

1.2.2數(shù)據(jù)預(yù)處理和RNAs的重注釋

利用R軟件的affy包進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，對RNAs進(jìn)行重注釋。使用Agilent GeneSpring GXv12.1軟件進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)均一化處理和差異分析，經(jīng)過折疊倍率(fold change，F(xiàn)C)篩選出所有差異表達(dá)的RNAs，|lofFC|≥0.3，P<0.05。

1.2.3Wnt信號通路的功能富集和通路分析

使用富集分析工具對Wnt信號通路進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)分析，描述該信號通路中基因的表達(dá)趨勢；同時(shí)將Wnt信號途徑的調(diào)節(jié)進(jìn)行GO和REACTOME富集分析比較，進(jìn)一步闡述TGF-β因子與Wnt信號通路的相互關(guān)系。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR和激光共聚焦驗(yàn)證

(1)為了驗(yàn)證TGF-β和Wnt4之間的相互關(guān)系，設(shè)立空白組、TGF-β組(5 ng/mL)及Wnt4組(250 ng/mL)，作用24 h后收集細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后對FN1、平滑肌肌動(dòng)蛋白A2(smooth muscle actin A2，ACTA2)、Wnt4進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。(2)為了探討趕黃草是否通過Wnt4影響TGF-β介導(dǎo)的肺纖維化，對MRC-5細(xì)胞進(jìn)行了趕黃草的毒性實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白組、TGF-β組、趕黃草+TGF-β組，在MRC-5細(xì)胞中加入TGF-β處理6 h后加入趕黃草(50 μg/mL)，培養(yǎng)24 h后，激光共聚焦檢測FN1和Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(COL1A1)蛋白熒光定量情況，同時(shí)收集細(xì)胞和提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。目的基因包括FN1、ACTA2、Wnt4蛋白的表達(dá)，見表1。

表1 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TGF-β組和對照組中差異表達(dá)基因

GEO數(shù)據(jù)庫中共獲得差異表達(dá)基因12 548個(gè)，在這些差異基因中有2 151個(gè)基因在TGF-β組低表達(dá)，有1 505個(gè)基因在TGF-β組高表達(dá)，其中Wnt4、ACTA2、COL1A1就屬于高表達(dá)基因，見圖1。利用聚類分析找出具有相同生物學(xué)過程或相似功能且差異比較明顯的基因100個(gè)，選取在TGF-β組表達(dá)升高和降低的基因各50個(gè)，結(jié)果表明TGF-β組與對照組MRC-5細(xì)胞標(biāo)本的生物學(xué)過程與功能區(qū)分比較明顯；TGF-β組Wnt信號途徑中Wnt4、ACTA2、COL1A1、FN1表達(dá)水平升高，其中Wnt4、ACTA2、COL1A1表達(dá)水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而FN1表達(dá)水平升高不明顯，見圖2。

紅點(diǎn)：表達(dá)水平升高基因；藍(lán)點(diǎn)：表達(dá)水平降低基因；黃點(diǎn)：表達(dá)無明顯差異基因；|lofFC|≥0.5，P<0.05。

A：TGF-β組和對照組中100個(gè)差異明顯基因熱圖(FC>2.0,P<0.05)；B：Wnt信號途徑中相關(guān)基因熱圖。

2.2 Wnt信號通路中基因富集分析

通過GO富集圖形分析，發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路途徑的調(diào)節(jié)基因與典型的Wnt信號通路中基因是一致的，且圖形中ES值前的領(lǐng)頭亞集形狀中功能基因集在TGF-β組具有更明顯的生物學(xué)意義。TGF-β組對不同數(shù)據(jù)庫的Wnt信號通路的富集分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β與Wnt信號通路的激活呈正相關(guān)，見圖3。

A：典型Wnt信號通路差異基因的GO富集分析；B：調(diào)節(jié)Wnt信號途徑的差異基因的GO富集分析；C：Wnt調(diào)節(jié)的信號通路差異基因的Reactome富集分析；D：Wnt信號通路中差異基因的KEGG分析。

2.3 TGF-β和Wnt4相互關(guān)系影響

為驗(yàn)證以上生物信息學(xué)分析的可靠性，在MRC-5細(xì)胞中加入TGF-β，發(fā)現(xiàn)FN1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，同時(shí)Wnt信號通路中Wnt4基因mRNA表達(dá)水平也升高(P<0.05)；為了進(jìn)一步說明TGF-β誘導(dǎo)肺纖維化是通過調(diào)控Wnt4，在MRC-5細(xì)胞中加入Wnt信號通路中的Wnt4進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)纖維化相關(guān)蛋白FN1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖4。

A：TGF-β處理后FN1 mRNA表達(dá)水平；B：TGF-β處理后Wnt4 mRNA表達(dá)水平；C：Wnt4處理后FN1 mRNA表達(dá)水平。

2.4 趕黃草調(diào)控Wnt4抑制TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化

為驗(yàn)證趕黃草對MRC-5細(xì)胞的毒性，加入了不同濃度的趕黃草進(jìn)行CCK8毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)趕黃草的濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)24 h后沒有明顯的細(xì)胞毒性。在MRC-5細(xì)胞中加入TGF-β處理后與空白組比較，其FN1、ACTA2、Wnt4 mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在TGF-β組加入趕黃草后，其FN1、ACTA2、Wnt4 mRNA水平較TGF-β組明顯降低(P<0.05)；同時(shí)通過激光共聚焦檢測各組MRC-5細(xì)胞中不同處理后的COL1A1和FN1蛋白熒光定量，其結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致，空白組COL1A1和FN1表達(dá)水平與TGF-β組比較明顯降低，趕黃草+TGF-β組與TGF-β組比較，其纖維化蛋白COL1A1和FN1的水平也明顯降低(P<0.05)，見圖5。

A：不同濃度的趕黃草對MRC-5細(xì)胞的活力影響；B：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測趕黃草對MRC-5細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)的Wnt信號通路的影響；C：共聚焦顯微鏡觀察趕黃草處理MRC-5細(xì)胞后Wnt信號通路中COL1A1和FN1的熒光強(qiáng)度；D：定量分析COL1A1和FN1熒光強(qiáng)度；a:P<0.05，與0 μg/mL趕黃草比較。

3 討 論

特發(fā)性肺纖維化是一種由異常的創(chuàng)傷愈合進(jìn)程導(dǎo)致的疾病，其中上皮細(xì)胞損傷啟動(dòng)炎性因子，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞異常增殖和膠原蛋白沉積[12-14]。TGF-β是一種對細(xì)胞分化增殖和炎性反應(yīng)具有綜合調(diào)節(jié)作用的多功能細(xì)胞因子[7]，在組織纖維化信號的啟動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[15]。此外，TGF-β誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)肺內(nèi)的肺泡上皮或內(nèi)皮細(xì)胞向遷移性成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[16]。Wnt信號通路是一組由蛋白質(zhì)組成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過細(xì)胞表面受體將信號從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)[17]。最近的研究表明，Wnt信號通路的成分已成為靶器官抑制纖維化的潛在靶點(diǎn)[18]。Wnt4是Wnt蛋白家族中的一員，作為局部作用的信號分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用、增殖和遷移[19]。對成人子宮Wnt4的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Wnt4可參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖、存活和分化[20]。Wnt4/β-catenin信號通路已經(jīng)證實(shí)可參與肝纖維化[21]、肺纖維化[22]的發(fā)生、發(fā)展。LAM等[23]報(bào)道Lrp5缺失小鼠由于廢除了Wnt/β-catenin信號通路，對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化具有保護(hù)作用。本研究對GEO數(shù)據(jù)庫的微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行GO和Wnt信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)TGF-β是調(diào)節(jié)Wnt信號途徑的一個(gè)重要因素，隨著TGF-β的加入Wnt信號途徑即被激活，這與SPANJER等[24]發(fā)現(xiàn)Wnt受體能介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)的促纖維化信號通路是一致的。但Wnt信號通路中配體、受體和共受體怎樣參與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化的調(diào)控尚不清楚。因此，了解Wnt調(diào)節(jié)的纖維化的潛在機(jī)制對于器官纖維化、鈣化和異常血管重構(gòu)等的有效治療是必不可少的。

近年來隨著臨床輔助檢查水平的不斷提高，越來越多的特發(fā)性肺纖維化患者在早期病程中被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，但目前該病尚無較好的治療手段，且治療的同時(shí)不良反應(yīng)較大。中藥在治療特發(fā)性肺纖維化上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，目前多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)中藥能改善特發(fā)性肺纖維化患者癥狀、肺功能，提高患者生活質(zhì)量，增加患者動(dòng)脈血氧分壓[25]。其中趕黃草作為一種天然草本植物，價(jià)格較低廉，研究發(fā)現(xiàn)趕黃草的提取物對乙醇或氧化性肝損傷具有保護(hù)作用[10]。從該植物中已鑒定出30多個(gè)具有抗氧化、抗癌和降血糖作用的化合物[9]。趕黃草中的生松素是中草藥中常見的一種類黃酮，在不同細(xì)胞系中已被報(bào)道具有抗肝硬化和抗纖維化成分[26]，且對肝纖維化有治療作用[11]。在用過氧化叔丁基誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷模型中，趕黃草中的水提物顯示出了對肝臟的保護(hù)作用[27]。為了進(jìn)一步研究趕黃草對肺纖維化的潛在機(jī)制，本研究在MRC-5細(xì)胞中加入TGF-β后，F(xiàn)N1、ACTA2表達(dá)基因上調(diào)明顯，說明TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化細(xì)胞模型成功，同時(shí)Wnt信號通路中的Wnt4基因表達(dá)也明顯升高，說明TGF-β能誘導(dǎo)Wnt4的表達(dá)。同時(shí)在MRC-5細(xì)胞中加入Wnt4后，纖維化相關(guān)的FN1表達(dá)水平也升高，說明Wnt4能調(diào)控纖維化，這與Wnt4/β-catenin信號通路可介導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展是一致的[22]。當(dāng)加入趕黃草后發(fā)現(xiàn)Wnt4表達(dá)明顯降低，同時(shí)纖維化相關(guān)基因FN1、ACTA2、COL1A1的表達(dá)水平也明顯下降，說明趕黃草對TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化具有保護(hù)作用，且可能是通過調(diào)控Wnt4實(shí)現(xiàn)的，這與LAM等[28]發(fā)現(xiàn)抑制Wnt信號通路可以有效抑制小鼠肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展一致。在高侵襲性鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞研究中，Wnt4還參與癌細(xì)胞晚期發(fā)生過程中細(xì)胞黏附，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和與上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變相關(guān)的侵襲[29]。SPANJER等[24]發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)ZD8能使TGF-β誘導(dǎo)的纖維化的Ⅰ型膠原、FN1、多能蛋白聚糖、ACTA2和結(jié)締組織生長因子表達(dá)水平降低，同時(shí)沉默F(xiàn)ZD7可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺纖維化，且能夠通過典型或非典型的Wnt信號通路進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與組織纖維化的調(diào)節(jié)[30]。結(jié)合上述研究結(jié)果，趕黃草可能通過抑制Wnt信號通路中的Wnt4基因來達(dá)到抗纖維化的目的。

綜上所述，趕黃草能降低TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化，可能是通過調(diào)控Wnt信號通路中的Wnt4實(shí)現(xiàn)的。由于趕黃草包含的藥理和化學(xué)成分比較復(fù)雜，不能明確趕黃草的哪種成分發(fā)揮抗肺纖維化作用，因此，后續(xù)將繼續(xù)對趕黃草的藥理進(jìn)行研究，以期待找出趕黃草抗纖維化的有效成分，為治療肺纖維化提供新的候選藥。