劉永玲，馬風(fēng)偉，趙治兵，楊怡，方麗紅，謝國芳*

（1．貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550005）

野地瓜（Ficustikoua Bur.）又名過山龍、地果、地瓜藤等，系?？崎艑俣嗄晟橘肽举|(zhì)藤本植物，為食藥兩用資源，該屬植物具有清熱利濕、活血通絡(luò)、解毒消腫、抗菌、抗腫瘤等作用[1]。野地瓜全株富含三萜類、黃酮類、酚酸類等成分[2]，課題組前期利用在線高效液相色譜-質(zhì)譜-二苯基三硝基苯肼技術(shù)篩選并鑒定出了野地瓜莖正丁醇相中存在新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸3種抗氧化活性成分[3]。目前關(guān)于野地瓜中綠原酸類化合物的研究僅報(bào)道了不同提取溶劑對綠原酸提取率的影響[4]，尚未見野地瓜中其它綠原酸成分及綠原酸類化合物提取工藝的研究。

綠原酸類化合物是分布于植物中的酚酸類化合物，具有保肝、抗炎抗菌、抗氧化、抗肥胖、抗高脂血癥及保護(hù)神經(jīng)等的生理功能，現(xiàn)已大量應(yīng)用到了食品加工、植源性化妝品和醫(yī)藥用品中[5]，因此尋找綠原酸類化合物的新來源是必不可少的。近年來研究綠原酸類化合物的提取方法有水提法、有機(jī)溶劑提取、分級萃取[6]、超聲波輔助[7]、微波輔助[8]、超臨界 CO2萃取[9]和生物酶法[10]等，這些方法中僅有有機(jī)溶劑提取在工業(yè)化生產(chǎn)中可行，且發(fā)現(xiàn)提取溶劑中乙醇為首選提取劑[11]，響應(yīng)面法是基于數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)快速建立模型方程得到最佳工藝的分析方法[12]。因此基于響應(yīng)面設(shè)計(jì)的回流提取可適用于野地瓜莖中綠原酸類化合物的工業(yè)化開發(fā)。

基于此，為制備這3種高純度化合物，本文引入總評歸一值（overall desirability，OD）來表達(dá)最終效應(yīng)，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化野地瓜莖中3種綠原酸化合物的熱回流提取工藝，采用DPPH自由基和ABTS＋自由基清除率來評價(jià)野地瓜莖提取物的抗氧化活性，為野地瓜中綠原酸類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野地瓜莖：于2019年6月采自貴州赫章縣白果鎮(zhèn)犀牛唐村高橋組，將野地瓜莖上觸底生長的不定性根去除，選取粗細(xì)略等的棕褐色野地瓜莖，經(jīng)干燥粉碎過60目篩備用；隱綠原酸、新綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：美國斯坦福分析化學(xué)品公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhy-drazyl，DPPH）：美國 Sigma公司；甲醇（色譜純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀、UV-2550紫外分光光度計(jì)、WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：日本島津公司；R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DF-101S集熱式加熱磁力攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測條件

色譜柱：WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動相：0.2%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序：0～8 min：80%～75%A；8 min～13 min：75%A；13 min～22 min：75%～65%A；22 min～23 min：65%A；23 min～35 min：65%～40%A；流速1.0mL/min；檢測波長300nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取野地瓜莖粉末1.0 g，加入60%乙醇15 mL，回流提取50 min，提取溫度60℃，提取兩次，過濾，合并提取液，無水乙醇定容至50 mL，HPLC測定前用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，即為供試品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品3.1、3.2、3.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，新綠原酸用70%甲醇溶解并稀釋至刻度線，綠原酸、隱綠原酸分別用甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，配制成濃度分別為310、320、300μg/mL的對照品儲備液，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取適量新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸對照品儲備液混合，甲醇定容，制成分別含新綠原酸6.2、12.4、18.6、24.8、31.0 μg/mL，綠原酸 48.0、96.0、144.0、192.0、240.0 μg/mL， 隱 綠 原 酸 6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，擬合峰面積（y）和進(jìn)樣濃度（x，μg/mL）作回歸曲線，分別得回歸方程：新綠原酸y=11 285x-18 905（R2=0.999 8），在 6.2 μg/mL～31.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系；綠原酸y=10 191x-32 565（R2=0.999 1），在 48.0 μg/mL～240.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系；隱綠原酸y=11 590x-18 115（R2=0.999 0），在6.0 μg/mL～30.0μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.3.3 3種綠原酸得率的計(jì)算

取野地瓜莖供試品溶液，用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，將峰面積代入相應(yīng)的回歸方程，即可求出新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的濃度，按式（1）分別計(jì)算3種綠原酸的得率。

式中：C為綠原酸類化合物的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量，g；10-3為質(zhì)量換算系數(shù)。

1.3.4 綠原酸類化合物提取工藝的優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

將1.3.2中野地瓜莖供試品溶液的制備參數(shù)作為基本工藝條件，控制其單一變量，以3種綠原酸得率的總評歸一值（OD）為標(biāo)準(zhǔn)，通過單因素試驗(yàn)考察乙醇濃度 40%、50%、60%、70%、80%；提取溫度 50、60、70、80、90 ℃；料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）3 個(gè)因素對3種綠原酸化合物得率的影響?？傇u歸一值（OD）是采用Hassan法對3種綠原酸化合物的得率標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的“歸一值（λ）”，之后對“歸一值（λi）”求算幾何平均數(shù)，即OD=（λ1，λ2，……，λn）1/n（n為指標(biāo)數(shù)）[13]。Hassan法中對取值越小越好的測量指標(biāo)用公式[λmin=（Imax-Ii）/（Imax-Imin）]，對取值越大越好的測量指標(biāo)用公式[λmax=（Ii-Imin）/（Imax-Imin）]，式中Ii為指標(biāo)測量值，Imax和Imin指每一指標(biāo)在同系列試驗(yàn)中的最大值和最小值[14]，本次試驗(yàn)3種綠原酸得率為有效成分的含量，取值均為越大越好。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件構(gòu)建三因素三水平的試驗(yàn)方案，確定3種綠原酸得率最大的最佳提取工藝。

1.3.5體外抗氧化活性測定

精密稱取野地瓜莖粉末10.0 g，選取響應(yīng)面試驗(yàn)方案中歸一值OD差別較大的3組工藝條件進(jìn)行提?。╪=3），提取液濃縮后于65℃烘箱下烘干，分別精密稱取3組工藝條件下野地瓜莖提取物10.0 mg，無水乙醇定容到25 mL，DPPH自由基清除率試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[15]，ABTS+自由基清除率試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[16]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

IBM SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行總評歸一值（OD）的計(jì)算及相關(guān)性分析，Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)、二次回歸方程的求解及結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野地瓜莖提取物中3種綠原酸的HPLC分析

根據(jù)1.3.1項(xiàng)下HPLC檢測條件，3種綠原酸的混合對照品及野地瓜莖供試品溶液的HPLC圖譜見圖1，此條件下可實(shí)現(xiàn)3種綠原酸化合物的基線分離。

圖1 混合對照品和野地瓜莖供試品溶液的HPLC圖Fig.1 HPLC of the mixed reference standards and Ficus tikoua Bur．stems test solution

2.2 單因素試驗(yàn)

不同乙醇濃度、提取溫度、料液比對3種綠原酸得率與總評歸一值（OD）的影響見圖2。

由圖2可知，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸分別在乙醇濃度為60%、70%、50%時(shí)得率最高，總評歸一值（OD）先升后降，在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)最高值，在乙醇濃度為70%～80%時(shí)歸一值OD下降，其原因可能為乙醇濃度較高時(shí)一些非極性物質(zhì)的溶出率增加，限制了野地瓜莖樣品中綠原酸類化合物的溶解[17]；由于乙醇濃度在60%、70%時(shí)歸一值OD差別不大，根據(jù)結(jié)果后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中乙醇濃度的選取范圍為50%～80%。由圖2可知，綠原酸在提取溫度為70℃、新綠原酸和隱綠原酸在溫度為80℃時(shí)得率最高。當(dāng)提取溫度為70℃時(shí)歸一值OD達(dá)最高值，在提取溫度為80℃～90℃時(shí)歸一值OD下降，其原因可能為綠原酸類化合物的同分異構(gòu)體在較高溫度下促進(jìn)溶出，但溫度過高可破壞其穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)[18]，由于提取溫度在70、80℃時(shí)歸一值OD差別不大，根據(jù)結(jié)果后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中提取溫度的選取范圍為60℃～90℃。新綠原酸和綠原酸在料液比 1∶25（g/mL）、隱綠原酸在料液比 1∶30（g/mL）時(shí)得率最高，料液比為1∶25（g/mL）時(shí)歸一值OD最大，隨后有所下降，其中新綠原酸和綠原酸在料液比為1∶30（g/mL）時(shí)得率下降的原因可能為底物濃度隨著提取溶劑用量的增加而使分子間的碰撞機(jī)會減少[19]。根據(jù)結(jié)果后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中料液比的選取范圍為1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）。

圖2 不同乙醇濃度、提取溫度和料液比對3種綠原酸得率及總評歸一值（OD）的影響Fig.2 Effect of extraction ethanol concentrations，extraction temperature，and solid-liquid ratio on the extraction yield of three chlorogenic acid compounds and OD values

2.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與回歸模型的建立

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比（A）、乙醇濃度（B）和提取溫度（C）為自變量，以新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸得率的歸一值OD（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。通過Box-Behnken中心組合的17組試驗(yàn)的響應(yīng)面分析結(jié)果見表2。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.3.2 回歸模型的方差分析

以總評歸一值（OD）為考察指標(biāo)，采用Design Expert 8.0.6.1軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得二次回歸方程：Y=0.920+0.063A-0.099B-0.029C+0.045AB-0.024AC+0.022BC-0.230A2-0.470B2-0.088C2。響應(yīng)面結(jié)果的方差分析見表3。

由表 3可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.996 5，說明模型擬合程度良好，失擬項(xiàng)P=0.914 7＞0.05，模型失擬度不顯著；其中一次項(xiàng)A、B（P＜0.000 1）、C（P=0.002 1）和二次項(xiàng) A2、B2、C2（P＜0.000 1）對響應(yīng)值 OD 的影響極顯著（P＜0.01）；AB（P=0.001 3）對響應(yīng)值 OD 的影響極顯著（P＜0.01），AC（P=0.030 8）、BC（P=0.038 0）對響應(yīng)值 OD 的影響顯著（P＜0.05），說明各因素對響應(yīng)值OD的影響并不是單純的線性關(guān)系。由顯著性及F值可知，對響應(yīng)值OD（Y）影響程度的大小依次為乙醇濃度（B）＞料液比（A）＞提取溫度（C）。

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

2.3.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析

根據(jù)二項(xiàng)式模型回歸方程，響應(yīng)面及等高線圖形狀可以反映出兩因素交互作用的強(qiáng)弱和顯著程度，響應(yīng)面坡度越陡峭、等高線呈橢圓形表明交互作用越顯著[20]。各因素交互作用對OD值的曲面圖見圖3。

由圖3可知A、B對響應(yīng)值OD的影響成拋物線形，在乙醇濃度為62%～68%和料液比在1∶26（g/mL）左右時(shí)響應(yīng)值OD達(dá)到最高值，且AB交互作用下等高線圖形所呈現(xiàn)的橢圓形極顯著，說明乙醇濃度和料液比的交互作用強(qiáng)于其它交互項(xiàng)。由圖3可知提取溫度對響應(yīng)值OD的影響相對于乙醇濃度和料液比的影響較小，但AC、BC之間所呈橢圓形顯著，表明AC、BC之間的交互作用對響應(yīng)值OD的影響顯著（P＜0.05）。

圖3 各因素交互作用對OD值的曲面圖Fig.3 Response surface plots of interaction of various factors on OD value

2.3.4 最佳提取工藝確定及模型驗(yàn)證

根據(jù)模型方程得到野地瓜莖中3種綠原酸提取的最佳工藝為：乙醇濃度為63.43%，料液比為1∶25.68（g/mL），提取溫度為72.05℃，此條件下響應(yīng)值OD的預(yù)測值為0.928 0。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)，設(shè)定乙醇濃度為63%，料液比為 1∶26（g/mL），提取溫度為 72 ℃，進(jìn)行提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），此條件下實(shí)際測得新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的得率分別為（0.933±0.014）、（10.428±0.117）、（0.910±0.012）mg/g，OD 值為 0.920 1±0.023 0，二項(xiàng)式擬合方程預(yù)測值與實(shí)測值的偏差為0.85%，二項(xiàng)式擬合效果好，可信度高。

2.4 野地瓜莖提取物體外抗氧化作用

根據(jù)總評歸一值OD，選取表2響應(yīng)面試驗(yàn)方案中OD最小值（第1組，編號：A組）、OD中間值（第4組，編號：B組）和模型預(yù)測最佳工藝組（編號：C組），按1.3.6項(xiàng)下方法進(jìn)行自由基清除率試驗(yàn)，A、B、C組提取工藝下野地瓜莖提取物和對照組VC對DPPH自由基清除活性的 IC50分別為（27.98±0.57）、（26.80±0.54）、（24.32±0.52）、（15.49±0.46）μg/mL，對 ABTS+自由基清除活性的 IC50分別為（77.10±0.83）、（73.08±0.79）、（67.52±0.89）、（45.03±0.52）μg/mL，由此得到 A、B、C組工藝下野地瓜莖提取物和VC對照組清除DPPH自由基、ABTS+自由基能力的順序依次為VC＞C組＞B組＞A組。

不同提取工藝下野地瓜莖中3種綠原酸得率變化與抗氧化作用的相關(guān)性分析見表4。

表4 不同提取工藝下野地瓜莖中3種綠原酸得率變化與抗氧化作用的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of three chlorogenic acid contents and antioxidant activities in the Ficu stikoua Bur．stems under different extraction processes

如表4所示，不同提取工藝下野地瓜莖提取物中3種綠原酸成分對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除能力貢獻(xiàn)顯著，使得不同工藝下野地瓜莖提取物的體外抗氧化能力有所差異，且最佳工藝下野地瓜莖提取物的抗氧化活性較強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析法對野地瓜莖中3種綠原酸的熱回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定的最佳工藝條件為乙醇濃度 63%、料液比 1∶26（g/mL）、提取溫度 72℃，此條件下測得新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸得率分別為（0.933±0.014）、（10.428±0.117）、（0.910±0.012）mg/g，響應(yīng)值OD為0.920 1±0.023 0；將總評歸一值（OD）作為響應(yīng)值得到各因素的影響次序依次為：乙醇濃度（B）＞料液比（A）＞提取溫度（C）；野地瓜莖提取物經(jīng)體外抗氧化試驗(yàn)具有較好的抗氧化活性，相關(guān)性分析顯示野地瓜莖在不同工藝下提取3種綠原酸得率的變化對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除能力貢獻(xiàn)顯著。

另有，本試驗(yàn)采取綜合考察模式“歸一值”（OD）表達(dá)多個(gè)有效指標(biāo)的綜合效應(yīng)，建立的回歸模型方程對整體提取工藝的優(yōu)化與預(yù)測更加直觀，該工藝試驗(yàn)的優(yōu)化及抗氧化能力的測定為野地瓜莖中抗氧化化合物的開發(fā)提供了依據(jù)，也為課題組后期3種化合物的分離制備和活性篩選奠定了基礎(chǔ)。