蒲瑩，王樹(shù)林，2，3*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是青藏高原特色資源多棘刺灌木植物，其果實(shí)具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血壓和保肝等生理活性[1]。黑果枸杞汁中酶促褐變的關(guān)鍵酶多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）能催化酚類(lèi)羥基轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，再催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為有色醌類(lèi)物質(zhì)，最終造成褐變[2]，而且多酚氧化酶能促進(jìn)黑果枸杞汁中關(guān)鍵抗氧化活性物質(zhì)多酚類(lèi)和花青素的降解[3]，導(dǎo)致其保健功能和生理作用的減弱。由于酶是一類(lèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，它的功能活性與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。近年來(lái)，相關(guān)學(xué)者為研究酶活性變化的相關(guān)機(jī)理，對(duì)其蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了相關(guān)探究。相關(guān)研究都表明可以在分子水平探討酶活性變化的機(jī)理，從而為減緩黑果枸杞汁氧化褐變提供有效思路。

超高壓（ultra-high pressure，UHP）技術(shù)是一種在食品行業(yè)中極具發(fā)展?jié)摿Φ氖称芳庸し椒?，能在較低或者常溫條件下，不改變小分子物質(zhì)及共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)，卻能改變生物體中高分子物質(zhì)的非共價(jià)結(jié)構(gòu)[4]，所以超高壓技術(shù)在有效鈍化酶活性的同時(shí)能更好地保證食品營(yíng)養(yǎng)成分和感官性能。目前少有關(guān)于青藏特色資源黑果枸杞汁的加工與貯藏的研究。黑果枸杞活性物質(zhì)花青素的極不穩(wěn)定和內(nèi)源酶導(dǎo)致的氧化褐變都會(huì)影響其果汁的加工，將超高壓技術(shù)應(yīng)用于黑果枸杞汁的加工，有利于內(nèi)源酶的鈍化和延緩活性成分的流失。目前鮮有關(guān)于超高壓對(duì)于黑果枸杞汁中多酚氧化酶活性影響的研究，對(duì)酶結(jié)構(gòu)影響及作用機(jī)理研究則更少。

故本文研究在不同壓力（200 MPa～500 MPa）條件下，黑果枸杞汁中的關(guān)鍵性?xún)?nèi)源酶多酚氧化酶活性、結(jié)構(gòu)以及形態(tài)特征的變化，以期改善黑果枸杞汁品質(zhì)，探索黑果枸杞汁的加工新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞：采于青海省諾木洪地區(qū)。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨（ammonium 8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：北京索萊寶科技有限公司；多酚氧化酶試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HHP600/5L超高壓處理設(shè)備：包頭科發(fā)高壓科技有限公司；ZD-LZ-0.5螺旋榨汁機(jī)：靖江市中德機(jī)械制造廠；Nicolet6700傅立葉紅外光譜儀：美國(guó)熱電公司；DSC-200F3差示掃描量熱儀：德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；JSM-6610掃描電子顯微鏡：日本電子公司；RF-6000熒光分光光度計(jì)：島津企業(yè)（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑果枸杞汁中PPO提取

PPO的提取參照林波等[5]的方法，并稍作修改。將黑果枸杞榨汁后與磷酸鹽緩沖液（pH6.5，0.1 mol/L）和4%PVPP等體積混合，4℃條件下靜置1 h，10 000 r/min離心20 min，得到上清液即為黑果枸杞汁PPO粗提液。

1.3.2 超高壓處理

將得到的黑果枸杞汁PPO粗提液分別罐裝于耐壓塑料瓶中，用封口膜密封。采用超高壓設(shè)備分別于200、300、400、500 MPa 壓力下處理 10 min，不做任何壓力處理的作為空白對(duì)照[6]。

1.3.3 PPO活性測(cè)定

PPO活性的測(cè)定采用試劑盒法[7]，在420 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算酶活性。

1.3.4 差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）分析

參考朱玉兵等[8]的方法，采用差示掃描量熱儀對(duì)黑果枸杞PPD進(jìn)行分析，加熱速率為5℃/min，溫度范圍為25℃～85℃。使用DSC分析軟件（TA Universal Analysis 2000）估算DSC熱譜圖中的峰值溫度和峰面積，分別定義為熱變性溫度（T）和熱變性焓（ΔH）。

1.3.5 表面疏水性分析

參考余晶梅等[9]的方法，采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定黑果枸杞汁PPO的表面疏水性。使用ANS作為熒光探針，用0.01 mol/L PBS與0.15 mol/L NaCl混合液將樣品稀釋至 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，分別加入80μLANS，20℃避光平衡1h，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)470nm，狹縫寬度5nm，掃描速率1200nm/min，以熒光強(qiáng)度對(duì)其濃度作圖，圖線的初始斜率即為酶蛋白表面疏水性指數(shù)S0。

1.3.6 傅立葉紅外光譜（Fourier infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

參照Z(yǔ)HU等[10]的方法，將處理得到樣品冷凍干燥，在400 cm-1～4 000 cm-1波長(zhǎng)范圍進(jìn)行傅立葉紅外光譜的測(cè)定。

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜分析

參考周雅琪等[11]的方法，將1.3.1中制得的PPO粗提液放入熒光比色皿中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為295nm，掃描范圍為200nm～600 nm，激發(fā)和發(fā)射縫寬為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.3.8 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）分析

用掃描電子顯微鏡分析黑果枸杞PPO的形態(tài)特征[12]，將樣品冷凍干燥后用掃描電子顯微鏡進(jìn)行掃描，觀察其形態(tài)特征。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，采用Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)黑果枸杞汁PPO活性的影響

超高壓處理對(duì)黑果枸杞汁PPO活性的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同壓力下黑果枸杞汁PPO活性Fig.1 PPO activity of Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures

如圖 1所示，經(jīng)超高壓（200 MPa～500 MPa）處理的黑果枸杞汁PPO活性分別為（25.83±1.12）、（28.29±0.88）、（0.49±0.34）、（0.48±0.20）U/mL，未經(jīng)任何處理的樣品PPO活性為27.28 U/mL。300 MPa處理酶活性略有升高，但與對(duì)照組差異不顯著（p＞0.05），略微升高的原因可能是分子在一定的空間范圍內(nèi)，受到壓力作用，使得酶與底物更加充分地接觸從而有所升高。壓力繼續(xù)增大使PPO活性降低，400 MPa和500 MPa能使酶活性降低至0.5 U/mL以下（p＜0.05）。JUAREZENRIQUEZ等[13]研究發(fā)現(xiàn)在壓力較低的情況下，壓力大小與PPO失活速率有拮抗作用，壓力越大，失活速率越小，當(dāng)壓力高于300 MPa時(shí)，壓力大小對(duì)PPO的失活速率有協(xié)同作用，壓力越大，失活速率越大。

2.2 DSC檢測(cè)分析結(jié)果

在差示掃描量熱過(guò)程中，一定的蛋白結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)固定的吸收峰，即目標(biāo)蛋白的特征峰，一旦蛋白發(fā)生部分變性或者完全變性，便伴隨著其在差示掃描量熱圖譜上特征吸收峰出現(xiàn)峰值變小或者變性溫度發(fā)生位移甚至消失的情況[14]。

不同處理壓力下黑果枸杞汁PPO蛋白差示掃描量熱結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，空白對(duì)照組和200 MPa處理組均能觀察到明顯脫色峰，200 MPa與空白對(duì)照組相比，第一個(gè)變性吸收峰約降低三分之二，300 MPa處理有吸收峰出現(xiàn)，但峰值明顯變小，隨著壓力的升高特征峰出現(xiàn)了明顯降低現(xiàn)象，400 MPa和500 MPa處理組經(jīng)DSC分析未出現(xiàn)明顯脫色峰，說(shuō)明該條件已經(jīng)使PPO的蛋白構(gòu)象被破壞，從而發(fā)生變性現(xiàn)象，這與2.1酶活性所得結(jié)果基本一致，說(shuō)明酶活性的大小與蛋白分子熱穩(wěn)定性有關(guān)，酶蛋白分子構(gòu)象變化，導(dǎo)致活性發(fā)生變化。

圖2 不同壓力下黑果枸杞汁PPO差示掃描量熱法分析圖Fig.2 Differential scanning calorimetry of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures

熱變性溫度（T）和熱變性焓（ΔH）結(jié)果如表 1所示。

表1 不同壓力處理黑果枸杞汁PPO的DSC熱變性溫度和熱變性焓Table 1 DSC denaturation temperature and enthalpy of denaturation of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice treated with different pressures

200MPa高壓處理的熱變性溫度與空白對(duì)照沒(méi)有顯著差異（p＞0.05），但是熱變性焓顯著降低（從200.90 J/g降低到了52.66 J/g）（p＜0.05），表明ΔH的變化和處理壓力有關(guān)，在超高壓處理?xiàng)l件下，熱穩(wěn)定性與分子結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，因此，隨著壓力的增加ΔH降低，可能是酶蛋白結(jié)構(gòu)軸向壓力的作用逐漸占主導(dǎo)，并且更多的三螺旋結(jié)構(gòu)開(kāi)始從末端肽區(qū)域解離。這與NAN等[15]研究的壓力對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響結(jié)果不一致，該研究發(fā)現(xiàn)處理壓力低于300 MPa時(shí)，ΔH顯著增加，造成這種差異的原因可能是由于不同原料的蛋白結(jié)構(gòu)耐壓性不同。

2.3 表面疏水性分析

酶蛋白表面疏水性的變化是酶蛋白結(jié)構(gòu)變化的重要表征，正常情況下，為了保證蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，大多數(shù)的非極性氨基酸會(huì)排布在分子內(nèi)部疏水性區(qū)域，形成穩(wěn)定的疏水性?xún)?nèi)核，蛋白質(zhì)分子表面排布著極性氨基酸，保證親水環(huán)境的穩(wěn)定，并與內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行能量交換和分子輸出[16]。在超高壓作用下，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水性氨基酸在分子內(nèi)外重新排布，使更多疏水性氨基酸殘基在壓力作用下暴露在蛋白分子表面。

不同高壓處理對(duì)黑果枸杞汁PPO蛋白表面疏水性影響如圖3所示。

由圖3可知，處理壓力200 MPa～400 MPa時(shí)，隨著壓力的增大，黑果枸杞汁PPO蛋白的表面疏水性在逐漸增強(qiáng)。說(shuō)明在壓力作用下，PPO蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，原本的疏水性側(cè)鏈在天然蛋白狀態(tài)下聚集于蛋白分子內(nèi)部，由于受壓力作用，這些疏水性側(cè)鏈重新排布后，便會(huì)有疏水性氨基酸殘基移動(dòng)到蛋白表面，酶蛋白分子之間凝聚性減弱，表面疏水性增加，酶活性降低。

圖3 不同壓力下黑果枸杞汁PPO表面疏水性Fig.3 The surface hydrophobicity of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures

2.4 超高壓對(duì)黑果枸杞汁PPO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

不同壓力處理的黑果枸杞汁PPO的傅立葉紅外光譜圖如圖4所示。

從圖4中可以觀察到PPO蛋白的典型吸收峰。酰胺 A 譜帶（3 400 cm-1～3 440 cm-1）與 N-H 拉伸振動(dòng)相關(guān)，酰胺 I譜帶（1 600 cm-1～1 660 cm-1）是酶蛋白中最強(qiáng)的吸收帶，與肽鍵中羰基的拉伸振動(dòng)相關(guān)，酰胺I譜帶內(nèi)官能團(tuán)的變化極易影響酶蛋白主鏈結(jié)構(gòu)，因此二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也易受其影響。酰胺II譜帶（1 400 cm-1～1 550 cm-1）與N-H彎曲和C-N伸展相關(guān)，蛋白質(zhì)的酰胺II譜帶幾乎不受側(cè)鏈振動(dòng)的影響，而酰胺III譜帶（1 220cm-1～1 300 cm-1）與 C-N 鍵和 N-H 伸展相關(guān)，并與酶蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)[17]。與未處理的空白對(duì)照相比，高壓處理組在酰胺A譜帶略有藍(lán)移（從3 426.12 cm-1至3 388.13 cm-1），這表明超高壓處理可能使酶蛋白分子結(jié)構(gòu)中形成更多或者更強(qiáng)的氫鍵結(jié)構(gòu)。其它特征譜帶沒(méi)有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明本試驗(yàn)中的處理壓力對(duì)黑果枸杞汁PPO蛋白結(jié)構(gòu)中酰胺II譜帶和酰胺III譜帶沒(méi)有造成影響。柳青[18]在研究超高壓對(duì)西瓜汁多酚氧化酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，壓力越大，PPO在傅立葉紅外光譜圖中酰胺I譜帶形成的峰越明顯，經(jīng)過(guò)600 MPa處理后，對(duì)酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變最明顯，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，原因可能是由于原料不同或是原料中的PPO蛋白分子結(jié)構(gòu)不同。

圖4 不同壓力下黑果枸杞汁PPO傅立葉紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectrum of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures

2.5 內(nèi)源熒光光譜分析

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)內(nèi)含有內(nèi)源性熒光殘基，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子受到超高壓作用后，其分子構(gòu)象可能發(fā)生變化，這一過(guò)程的發(fā)生伴隨著酪氨酸和色氨酸空間位置的變化，表現(xiàn)為酪氨酸熒光性減弱和色氨酸熒光性增強(qiáng)的現(xiàn)象[19]。

當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，蛋白質(zhì)中的色氨酸能夠發(fā)射熒光，多酚氧化酶蛋白氨基酸殘基因?yàn)槭芨邏禾幚矶l(fā)生改變，這些氨基酸殘基內(nèi)源熒光強(qiáng)度相應(yīng)也會(huì)受到影響，所以可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)判斷酶蛋白結(jié)構(gòu)變化[20]。黑果枸杞汁多酚氧化酶經(jīng)過(guò)不同高壓處理和對(duì)照組的熒光光譜如圖5所示。

圖5 不同壓力下黑果枸杞汁PPO熒光光譜圖Fig.5 The fluorescence spectrum of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures

由圖5可知，未經(jīng)過(guò)任何處理的酶蛋白在363 nm處有最大熒光強(qiáng)度，經(jīng)不同壓力處理的PPO蛋白熒光強(qiáng)度均有所降低且都低于空白對(duì)照組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)壓力大小對(duì)PPO蛋白熒光光譜的形狀及最大吸收波長(zhǎng)影響不顯著，但是對(duì)熒光強(qiáng)度影響明顯。LEFEVRE等[21]研究發(fā)現(xiàn)色氨酸殘基在蛋白分子內(nèi)部極性環(huán)境內(nèi)，最大吸收波長(zhǎng)為360 nm。在壓力為200 MPa和300 MPa條件下，最大吸收波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)現(xiàn)象，說(shuō)明這樣的壓力大小不足以使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，壓力增加到400 MPa和500 MPa，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移（從360 nm移至364 nm處），并且隨著壓力的增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，說(shuō)明在超高壓400MPa和500MPa作用下，色氨酸殘基所處的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，內(nèi)部非極性環(huán)境的色氨酸殘基在高壓作用下，更多地暴露于蛋白分子外部的極性環(huán)境[22]，這表明超高壓處理對(duì)黑果枸杞汁中多酚氧化酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，因此推測(cè)酶蛋白構(gòu)象的變化可能會(huì)影響酶活性的變化。

2.6 電子顯微形態(tài)觀察

黑果枸杞汁多酚氧化酶經(jīng)過(guò)不同高壓處理和對(duì)照組的掃描電鏡圖如圖6所示。

圖6 不同壓力下黑果枸杞汁PPO掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures

將所有處理組在同等倍數(shù)（2 000倍）下放大，未經(jīng)任何處理的PPO蛋白以鏈狀形態(tài)存在，并且相互交聯(lián)，束狀空間結(jié)構(gòu)完整，經(jīng)過(guò)超高壓處理后，PPO蛋白束狀完整結(jié)構(gòu)消失，包裹在其中的顆粒狀物質(zhì)裸露在表面，同時(shí)伴隨著物質(zhì)粒徑減小，表面結(jié)構(gòu)已經(jīng)從光滑鏈狀變?yōu)榇植诘膸Э浊蛐晤w粒，較小的顆粒狀物質(zhì)團(tuán)聚黏結(jié)在未破碎的大顆粒表面。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著壓力的增大，蛋白酶分子間的間隙逐漸增大，因此圖像顯示超高壓處理對(duì)黑果枸杞汁多酚氧化酶蛋白的表面形態(tài)有一定影響。

3 結(jié)論

高壓通過(guò)改變黑果枸杞汁中PPO蛋白分子的構(gòu)象來(lái)改變酶的活性，400 MPa以上壓力能使其活性顯著降低。其中，高壓處理后酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)與常壓下酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯差異，研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致黑果枸杞汁PPO活性變化的原因是在高壓條件下，PPO蛋白分子三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性增強(qiáng)，并更多暴露于蛋白質(zhì)分子外部極性環(huán)境，導(dǎo)致表面疏水性的變化，超高壓處理也改變了PPO蛋白表面形態(tài)，也就是說(shuō)，一定的超高壓處理使黑果枸杞汁多酚氧化酶三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并引起蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致酶活性的改變，此研究結(jié)果為超高壓處理后黑果枸杞汁保存期的延長(zhǎng)和品質(zhì)提升提供一定的理論依據(jù)。