于海洋，彭新顏，崔曉穎，常高坦，劉凱麗

（1.山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東 煙臺 264670；2.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005）

我國是世界第一大淡水魚生產(chǎn)消費國，隨著魚類產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在魚類加工過程中產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，占魚類總產(chǎn)量的30%～50%，其中每年魚鱗下腳料就高達30萬噸[1]。研究表明，魚鱗含有豐富的蛋白質(zhì)，較多的卵磷脂、多種不飽和脂肪酸，還含有鈣、鐵、鋅等多種礦物質(zhì)和多種微量元素。但由于加工技術(shù)落后、資源綜合利用觀念薄弱，魚鱗在加工時多數(shù)被直接丟棄，易造成嚴重的環(huán)境污染和資源浪費[2-3]。

近年來，利用酶水解技術(shù)對海洋資源副產(chǎn)物進行高值化、生態(tài)化利用，特別是功能多肽的制備日益受到國內(nèi)外專家的關(guān)注[4-6]。研究表明，抗氧化肽的活性不僅與原料的來源、理化性質(zhì)有關(guān)，還受抗氧化肽的制備工藝及水解程度等影響。但國內(nèi)對海洋廢棄物多肽的抗氧化效果評價多限于某些化學(xué)指標(biāo)的測定，靈敏度不高。電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）法可用于定性和定量檢測物質(zhì)原子或分子中所含的不配對電子，是目前檢測自由基最靈敏的方法[7]。因此，本研究以消費量較大的淡水魚——鯉魚（Cyprinus carpio）的魚鱗為原料，利用ESR法測定堿性蛋白酶解產(chǎn)物的自由基清除能力和Fe2＋螯合能力，并通過單因素和響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化抗氧化肽的制備條件，以期為淡水魚鱗的深加工及綜合利用提供技術(shù)指導(dǎo)，并有望提高魚鱗的利用率和附加值，為生產(chǎn)功能性食品尋求新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淡水魚鱗：市售；堿性蛋白酶（6×104U/g）：丹麥諾維信（NOVO）公司；丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、二甲基吡咯啉氮氧化物（dimethyl pyrroline nitrogen oxide，DMPO）、菲洛嗪（Ferrozine）：Sigma公司；抗壞血酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、核黃素、氯化亞鐵（分析純）：煙臺魯杰試劑公司。

ER 200D-SRC電子自旋共振儀（ESR儀）：德國Bruker公司；GT16-3型高速臺式離心機：北京醫(yī)用離心機廠；AL-104型精密電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；pB-10型pH計：新銳儀表儀器有限公司；UV2600/2700紫外可見分光光度計：日本島津公司；ZHWY-1102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LGJ-18S真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 魚鱗膠原粗蛋白酶解過程

參考華萍[8]的試驗方法并有所改動：洗凈魚鱗→烘干、切碎→酸浸脫鈣（0.4 mol/L HCl，浸泡24 h并換一次酸）→清水沖洗至中性→石灰水浸泡24 h除雜→沖洗過濾至中性→調(diào)整pH值至2.5→35℃下胃蛋白酶提取膠原蛋白（提取60 h）→過濾后將濾液鹽析24 h（0.9 mol/L氯化鈉）→離心（16 000×g，20 min）→透析24 h后凍干→得膠原蛋白→酶解→離心分離（4 000×g，20 min）→取上清液濃縮→真空干燥→得魚鱗膠原蛋白酶解物。

1.3 水解度的測定

根據(jù)pH-Stat法[9]，水解度計算公式為：DH/%=h/htot×100，式中：htot為每克蛋白質(zhì)具有肽鍵的毫摩爾數(shù)，mmol/g蛋白質(zhì)，魚鱗膠原蛋白htot為8.41 mmol/g蛋白質(zhì)[10]；h為每克蛋白質(zhì)中水解的肽鍵量，mmol/g蛋白質(zhì)。

1.4 ESR法測定羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力

羥基自由基由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，參照Liu等[11]的方法稍有改動。水解樣品（50 μL）作對照，依次加入到50 μL的二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO）、10 mmol/L的硫酸亞鐵、50 μL的過氧化氫（10 mmol/L）溶液，啟動反應(yīng)，將反應(yīng)體系吸入密封的毛細管中，3 min后用ESR光譜儀記錄DMPO-OH加合物圖譜。ESR操作參數(shù)：中心磁場3 385 Gs，微波功率20 mW，調(diào)制頻率100 kHz，調(diào)制幅度1.0 Gs，掃場時間300 s。超氧自由基利用紫外照射的EDTA/核黃素系統(tǒng)產(chǎn)生[12]。混勻后于365 nm紫外燈下照射1 min，吸入石英毛細管后測定。

清除率/%=（H0－H）/H0×100

式中：H和H0分別為樣品與空白波譜信號強度。其中羥基自由基以波譜信號第2個峰信號強度（高度）表示；超氧自由基以波譜第一峰來表示。

1.5 Fe2＋螯合能力的測定

參照彭新顏等[9]的方法稍作修改進行研究。對于Fe2＋的鰲合：1 mL 20 μmol/L 的 FeCl2與 1 mL 0.5 mmol/L的菲咯嗪混合后向其中添加0.5 mL的魚鱗水解物，在562 nm下讀取吸光值。

1.6 堿性蛋白酶單因素水解試驗

1.6.1 最佳酶解溫度

在酶解時間為4 h，底物濃度20 mg/mL，加酶量4%，pH8.5的條件下，選取酶解溫度分別為50、55、60、65、70℃，研究酶解溫度對水解度和O2-·、·OH清除率的影響。

1.6.2 最適加酶量

在底物濃度20 mg/mL，酶解時間為4 h，pH8.5，酶解溫度65℃的條件下，選取酶的添加量分別為2%、3%、4%、5%、6%，研究加酶量對水解度和 O2-·、·OH 清除率的影響。

1.6.3 最佳底物濃度

在酶解時間為4 h，pH8.5，加酶量為4%，酶解溫度65℃的條件下，選取底物濃度分別為5、10、15、20 mg/mL，研究底物濃度對水解度和O2-·、·OH清除率的影響。

1.6.4 最適pH值

在酶解時間為4 h，加酶量為4%，酶解溫度65℃，底物濃度20 mg/mL的條件下，選取pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，研究 pH 值對水解度和 O2-·、·OH 清除率的影響。

1.6.5 最適水解時間

在加酶量4%，底物濃度20 mg/mL，pH8.5，酶解溫度 65 ℃的條件下，在酶解時間分別為 1、2、3、4、5 h，研究酶解時間對水解度和O2-·、·OH清除率的影響。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素篩選出酶解溫度、pH值、酶解時間作為優(yōu)化因素，通過Box-Behnken設(shè)計，以O(shè)2-·、·OH清除率和Fe2＋螯合能力為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析，數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.0，因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計Table 1 Box-Behnken experimental design

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Sigmaplot12.0和Excel6.0作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix8.1軟件包中Linear Models程序和Design-Expert 8.0分析軟件，差異顯著性（P＜0.05）使用Tukey HSD程序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度和加酶量的確定

酶解溫度和加酶量對魚鱗蛋白水解效果的影響見圖1。

圖1 酶解溫度和加酶量對魚鱗蛋白水解效果的影響Fig.1 Effect of temperature and enzyme dose on hydrolysis efficiency of carp scales protein

如圖1所示，當(dāng)酶解溫度為65℃時，·OH清除率、O2-·清除率及水解度全部達到最大值，分別為84.33%、47.27%和34.83%。這是因為提高溫度后，酶解速度顯著提高，從而促進魚鱗膠原蛋白水解為抗氧化多肽。當(dāng)酶解溫度過高時，蛋白酶失活變性，降低了酶解效率，導(dǎo)致·OH清除率、O2-·清除率及水解度下降。因此，酶解溫度不宜過高，65℃較適宜。酶濃度會影響魚鱗膠原蛋白的酶解效果，從而影響酶解液的抗氧化活性[13]。由圖1可知，加酶量提高后，·OH清除率在加酶量為4%時取得最大值為71.20%，O2-·清除率在加酶量為6%時才能取得最大值為38.33%，水解度在加酶量為5%時取得最大值為42.47%，但由于此時水解過度，導(dǎo)致·OH清除率和O2-·清除率下降。綜合考慮成本等因素，加酶量采用4%。

2.2 底物濃度、pH值和酶解時間的確定

底物濃度、pH值和酶解時間對魚鱗蛋白水解效果的影響見圖2。

圖2 底物濃度、pH值和酶解時間對魚鱗蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration，pH and hydrolysis time on hydrolysis efficiency of carp scales protein

如圖2所示，底物濃度在5mg/mL～25mg/mL，隨著底物濃度的增加，·OH清除率、O2-·清除率及水解度逐漸增大，但當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃蟮揭欢ǔ潭群?，其變化就較平緩。在25 mg/mL時，·OH清除率以及水解度達到最大值，分別為86.73%和45.03%。但O2-·清除率在20 mg/mL時最大，達到38.57%，而在這兩種底物濃度時，水解物的·OH清除率、O2-·清除率及水解度方面并沒有顯著差異（P＞0.05）。這可能是由于低濃度的魚鱗膠原蛋白可有效地和酶接觸，而當(dāng)魚鱗膠原蛋白濃度進一步升高時，酶與底物接觸的機會減小，膠原蛋白未被完全水解，酶解液的抗氧化活性也受到影響[14]。因此，底物濃度以20 mg/mL為宜。

酶解環(huán)境的pH值能夠影響到酶的穩(wěn)定性、空間構(gòu)象、解離程度和解離狀況等方面，進而影響酶解反應(yīng)[15]。如圖2所示，隨著pH值的增大，·OH清除率、O2-·清除率和水解度開始逐漸增大，當(dāng)pH值為8.5時，·OH、O2-·清除率及水解度均達到最大值，分別為68.87%、52.77%和44.20%。此后，隨著pH值進一步增加，酶解液的自由基清除率和水解度均開始下降。以上結(jié)果說明，酶解pH值與水解物抗氧化活性之間不存在線性關(guān)系，酶解pH值以8.5為宜。

如圖 2 所示，在 1 h～4 h，·OH、O2-·清除率和水解度不斷上升，在 4 h 時，·OH、O2-·清除率、水解度全部達到最高值，分別為82.60%、54.77%和42.43%，表現(xiàn)出最強的抗氧化效果。酶解時間繼續(xù)延長，抗氧化效果反而下降。說明酶解時間與魚鱗水解物抗氧化活性之間不存在線性關(guān)系，只有在特定的水解度下，才具有最大的抗氧化能力。這可能是因為具有抗氧化活性的肽段被進一步水解為更小的肽段和氨基酸，導(dǎo)致肽段失活變性。所以，酶解時間以4 h為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取酶解溫度、pH值、酶解時間為變量，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗。堿性蛋白酶解工藝條件優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計進行了17組試驗，5組為中心點重復(fù)試驗，具體結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

本試驗利用Design-Expert 8.0軟件對O2-·清除率、·OH清除率與Fe2＋螯合能力等因素進行多元回歸擬合，得二次多項式擬合方程為Y1=65.22＋4.98X1-0.84X2＋5.79X3＋1.62X1X2＋1.38X1X3＋0.53X2X3-7.65X12-3.50X22-4.39X32，Y2=86.23 ＋5.11X1＋2.47X2＋5.48X3-1.14X1X2＋5.92X1X3＋1.04X2X3-10.98X12-11.21X22-16.07X32，Y3=59.97＋2.40X1＋0.716X2＋3.29X3＋1.42X1X2＋1.23X1X3-0.98X2X3-5.30X12-5.74X22-4.24X32。

O2-·清除率、·OH 清除率、Fe2＋螯合能力的二次回歸方程方差分析見表3、表4和表5。

表3 O2-·清除率的二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation of O2-·scavenging activity

表4 ·OH清除率的二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation of·OH scavenging activity

由表3可知，方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9832，P＜0.000 1，說明模型達到高度顯著水平，失擬項P=0.165 2，影響不顯著，說明該方程擬合良好；由表4可知，方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.988 8，P＜0.000 1，說明模型達到高度顯著水平，失擬項P=0.056 4，影響不顯著，說明該方程擬合良好；由表5可知，方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.987 8，P＜0.000 1，說明模型達到高度顯著水平，失擬項P=0.093 1，影響不顯著，說明該方程擬合良好。因此，可應(yīng)用3個方程描述各響應(yīng)變量與兩個相應(yīng)值之間的關(guān)系，以評價各因素對相應(yīng)值影響的顯著性。

表5 Fe2+螯合能力的二次回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation of Fe2+chelating ability

由表3可以看出，響應(yīng)值為O2-·清除率的模型：一次項X1（酶解溫度）和X3（酶解時間）影響極顯著，各響應(yīng)因素影響程度依次為X3＞X1＞X2，酶解時間對于酶解液O2-·清除率的影響最大；酶解溫度、酶解時間、pH值的交互作用影響不顯著；二次項對應(yīng)的響應(yīng)值影響均極顯著。

響應(yīng)值為·OH清除率的模型：一次項X1（酶解溫度）和X3（酶解時間）影響極顯著，一次項X2（pH值）對·OH清除率達到顯著水平，各響應(yīng)因素影響程度依次為X3＞X1＞X2，酶解時間對于酶解液·OH清除率的影響最大；酶解溫度與酶解時間的交互作用影響極顯著，酶解溫度與pH值、pH值與酶解時間交互作用影響不顯著；二次項對應(yīng)的響應(yīng)值影響均極顯著。

響應(yīng)值為Fe2＋螯合能力的模型：一次項X1（酶解溫度）和X3（酶解時間）影響極顯著，一次項X2（pH值）對Fe2＋螯合能力未達到顯著水平，各響應(yīng)因素影響程度依次為 X3＞X1＞X2，酶解時間對酶解液 Fe2＋螯合能力的影響最大；酶解溫度與pH值、酶解溫度與酶解時間的交互作用影響顯著，pH值與酶解時間交互作用影響不顯著；二次項對應(yīng)的響應(yīng)值影響均極顯著。各因素對響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖見圖3～圖5。

圖3 各因素對O2-·清除率的影響Fig.3 Response surface plots for the interactive effects of different variables on O2-·scavenging activity

通過圖3、圖4和圖5即可對各因素影響抗氧化活性效應(yīng)進行分析與評價。響應(yīng)面為平滑的曲面，且開口向下，說明在響應(yīng)曲面上存在最大響應(yīng)值，可從中確定最佳因素水平范圍。根據(jù)Box-Behnken試驗所得的二次多項式回歸方程和結(jié)果，對所建立的數(shù)學(xué)模型進行工藝參數(shù)的優(yōu)化，得到最佳酶解條件組合為pH8.56、酶解溫度66.66℃、酶解時間4.39 h，此時O2-·清除率為67.94%，·OH清除率為87.30%，F(xiàn)e2+螯合能力為61.00%。為了驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，根據(jù)實際對試驗條件進行調(diào)整后，選取酶解時間4.4 h、pH8.5、酶解溫度66.0℃，做3組平行試驗，得到的O2-·清除率達65.34%，·OH清除率80.24%，F(xiàn)e2+螯合能力達59.73%，此結(jié)果與最佳理論條件下所得的結(jié)果接近。

圖4 各因素對·OH清除率的影響Fig.4 Response surface plots for the interactive effects of different variables on the·OH scavenging activity

圖5 各因素對Fe2+螯合能力的影響Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of different variables on Fe2+chelating ability

2.4 魚鱗膠原蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較

魚鱗膠原蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較結(jié)果見表6。

如表6所示，魚鱗膠原蛋白酶解液在O2-·清除能力、·OH清除能力和Fe2＋螯合作用方面均高于未水解魚鱗膠原蛋白（P＜0.05）。O2-·清除率為 65.34%，未達到BHA及抗壞血酸的水平。而在·OH清除率和Fe2＋螯合作用方面達到（P＞0.05）或超過（P＜0.05）BHA及抗壞血酸的抗氧化活性。因此，魚鱗膠原蛋白酶解液是具有抗氧化潛力的多肽物質(zhì)。

表6 魚鱗膠原蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較結(jié)果Table 6 Comparison of antioxidant activities between scale collagen hydrolysate and common antioxidants

3 討論

近年來，利用響應(yīng)面分析方法對酶水解影響因素進行優(yōu)化，獲得制備抗氧化多肽的最佳條件，取得了良好的效果。如Ren等[16]對草魚肌漿蛋白進行酶解，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，在酶與底物比例為0.79%、水解時間為5.69 h、反應(yīng)溫度在52.15℃的條件下，酶解產(chǎn)物的自由基清除率最高。Lin等[17]獲得了堿性蛋白酶制備抗氧化肽的最佳條件：底物濃度5.16%、酶用量2.37%和pH值為6.66時，水解產(chǎn)物的還原能力在700 nm時高達1.533。Wang等[18]通過酶水解和超濾法得到了分子量為10 kDa～30 kDa蛋清抗氧化肽，并利用Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)面法研究了脈沖電場處理參數(shù)對抗氧化活性的影響。Yang等[6]響應(yīng)面設(shè)計得出磷酸濃度為6.7%、底物濃度為50%、蒸煮時間為180 min時，DPPH自由基清除效率最高。Teng等[19]、Lin 等[17]、Fang 等[14]和 áLVAREZ 等[15]也通過響應(yīng)面法獲得了制備不同蛋白抗氧化肽的最優(yōu)條件。在本試驗利用單因素試驗以及響應(yīng)面法，通過測定O2-·、·OH清除率及Fe2＋的螯合能力，也得到了酶解魚鱗膠原蛋白的最佳工藝條件。

抗氧化劑可以通過螯合過渡金屬離子來抑制氧化的發(fā)生。其中，鐵離子對細胞中活性氧自由基的形成起關(guān)鍵作用，因此試驗檢測了Fe2＋螯合能力[13]。結(jié)果表明，與常用抗壞血酸和BHA比，最優(yōu)條件下魚鱗膠原蛋白酶解液 Fe2＋螯合能力更強（P＜0.05），這可能是由于蛋白酶解使得肽鍵斷裂，自由氨基和羧基濃度的增加隔離了體系內(nèi)促氧化的金屬離子，從而提高了抗氧化效果。另一方面可能是由某些氨基酸殘基的暴露增加引起的，如組氨酸就具有金屬螯合能力。通過對魚鱗膠原蛋白質(zhì)的酶解，使具有金屬螯合能力的氨基酸殘基更多地暴露出來，增強了Fe2＋的螯合能力。

ESR檢測儀是測定自由基的最直接有效的重要工具，可以準(zhǔn)確地測定出物質(zhì)的抗氧化活性，因此，ESR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白多肽自由基測定試驗中。Liu等[11]通過應(yīng)用ESR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，豬血漿蛋白水解物具有一定的O2-·、·OH、DPPH自由基的清除能力。Peng等[12]通過ESR儀測定了不同分子量范圍多肽自由基的清除能力，研究表明，分子量為0.1 kDa～2.8 kDa范圍的多肽自由基清除效果最好。本試驗魚鱗膠原蛋白酶解液的自由基清除能力明顯高于未水解物（P＜0.05）。Sudhakar等[20]也研究表明，所得到的水解多肽具有較高的自由基清除效果。鰱魚鱗的胃蛋白酶水解物自由基清除活性最高，經(jīng)超濾后得到5個部分，利用ESR法發(fā)現(xiàn)，分子量＜1 kDa多肽部分的DPPH自由基、O2-·、·OH清除效果最佳，且可減輕H2O2誘導(dǎo)腸上皮Caco-2細胞的氧化應(yīng)激損傷[21]。

越來越多的研究表明，蛋白酶解后，所得到的特定多肽段抗氧化效果更好。如Cai等[22]得到分子量分別為640.74、618.89 Da和484.56 Da的草魚皮多肽段，具有較強的·OH和DPPH自由基清除能力。Wang等[23]也證實，分子量為1 kDa和1 kDa～3 kDa的玉米蛋白多肽，具有提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的作用。Girgih等[24]水解大西洋鱈魚后，再利用膜過濾和反相液相色譜法將分子量小于1 kDa的部分繼續(xù)純化為四部分，其中三部分多肽組分具有較好的抗氧化效果。與之相似，盧素珍等[25]和Huang等[13]分別利用草魚鱗和尖吻鱸及鯔魚為原料，發(fā)現(xiàn)水解多肽的抗氧化效果要優(yōu)于未水解物。這可能是由于蛋白水解后，其致密結(jié)構(gòu)被破壞，從而使更多具有抗氧化能力的氨基酸殘基暴露，抗氧化效果增強。研究發(fā)現(xiàn)，自由基清除作用可能是通過阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或螯合作用來實現(xiàn)抗氧化作用的，小分子多肽可在溶液與溶質(zhì)界面或者固相與氣相界面形成薄膜，從而防止氧化的發(fā)生[12]。本試驗也說明，多肽的自由基清除能力和Fe2＋螯合能力對魚鱗蛋白多肽的抗氧化性起著重要作用。

4 結(jié)論

綜合響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及現(xiàn)實因素，確定魚鱗膠原蛋白實際水解工藝條件為酶解時間4.4 h、溫度66.0℃、pH8.5、底物濃度20 mg/mL、加酶量4%。此時酶液物的Fe2＋螯合能力、O2-·、·OH 清除率分別為59.73%、65.34%和80.24%，達到了響應(yīng)面最佳工藝效果。