袁娣，邵怡，張同瑤，姜阜杉，李秀榮，宋淇淇，通信作者

剛地弓形蟲截短型基因的克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

袁娣1，邵怡1，張同瑤1，姜阜杉1，李秀榮2，宋淇淇1，通信作者

（1.天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.巴彥淖爾市臨河區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古自治區(qū) 巴彥淖爾 015000）

為構(gòu)建剛地弓形蟲基因原核表達(dá)質(zhì)粒，利用SignalP-5.0軟件預(yù)測信號肽序列，去除前端信號肽序列，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增截短型基因序列，克隆并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果顯示：基因前51位氨基酸為信號肽區(qū)域，故將此段信號肽序列切除，獲得長度為 966 bp的截短型基因片段（SRS29Ccut），成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SRS29Ccut和pET-32a-SRS29Ccut。此研究為今后對剛地弓形蟲SRS29C蛋白的生物學(xué)功能及免疫特性進(jìn)行更深入研究打下基礎(chǔ)。

剛地弓形蟲；；截短型基因；原核表達(dá)質(zhì)粒

剛地弓形蟲是一種重要的人畜共患寄生蟲，可以感染包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血動物[1]。弓形蟲病具有極高的感染率，其感染主要是由不良或不干凈的飲食習(xí)慣和不合理飼養(yǎng)寵物等引起，人通過誤食未煮熟的含有弓形蟲包囊或速殖子的畜禽肉食或接觸感染貓糞便中的卵囊而感染[2]。免疫功能正常的人類感染弓形蟲后一般沒有明顯癥狀，而免疫功能亢進(jìn)患者感染后可能患腦炎，免疫功能受損的感染患者和經(jīng)胎盤獲得弓形蟲的先天性弓形蟲病患者可能發(fā)生嚴(yán)重疾病，且如果在懷孕期間感染會導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死產(chǎn)或畸胎[3]。

弓形蟲SRS蛋白家族是弓形蟲的蟲體表面抗原，部分SRS家族成員經(jīng)研究證實(shí)在弓形蟲的粘附、入侵、與宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)行互作等方面發(fā)揮重要作用。目前已知的多種剛地弓形蟲蟲體表面抗原均屬于SRS（SAG1-related sequence）蛋白超家族，其具有N端信號肽和C端疏水區(qū)域，成熟蛋白通過一個糖基磷脂?；℅PI）錨定位點(diǎn)與弓形蟲外表膜連接[4]。SRS抗原一方面在入侵宿主細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)和毒力衰減等方面發(fā)揮作用；另一方面，也為弓形蟲在宿主環(huán)境中生存提供相應(yīng)保護(hù)。

SRS家族主要有兩個分支，SAG1樣序列家族和SAG2樣序列家族。通過序列分析，該家族有161個SAG1相關(guān)序列（SRS）編碼，能組成多種結(jié)構(gòu)相關(guān)但抗原性不同的蟲體表面蛋白。SRS蛋白質(zhì)的表達(dá)具有期特異性[5-6]，其中，SAG1家族的蛋白主要表達(dá)在弓形蟲速殖子時期，包括SAG1、SAG2A、SAG3、SRS2、SRS3等；SAG2家族則選擇性地表達(dá)在緩殖子期，包括SAG2C、SAG2D、SAG2X、SAG2Y、BSR4、BAG1、SRS9等[7-9]，而SRS44和SRS13則在包囊囊壁上表達(dá)[10-11]。由此可以看出，弓形蟲生命周期中，速殖子、緩殖子和包囊的表面抗原表達(dá)譜具有明顯的獨(dú)特性，表面抗原相關(guān)序列不一樣，呈現(xiàn)出了不同的生物學(xué)特性和作用[12]。在弓形蟲終末宿主貓科動物的腸道內(nèi)，SRSs蛋白可以促進(jìn)識別大、小配子，受精和產(chǎn)生、擴(kuò)散卵囊，以及免疫反應(yīng)的能力，對腸道炎癥和腹瀉起到重要的作用[13]。所以，SRSs蛋白常被作為候選疫苗的成分之一。

本項(xiàng)目以弓形蟲基因作為研究對象，利用SignalP-5.0軟件對基因的N端信號肽進(jìn)行預(yù)測，去除其信號肽序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增截短型基因的PCR引物，此后通過PCR方法獲得的截短基因序列，將其連接到原核表達(dá)載體pET-28a和pET-32a中構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。本研究可以為今后對剛地弓形蟲SRS29C蛋白的生物學(xué)功能及免疫特性進(jìn)行更深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及主要試劑

質(zhì)粒pET-28a(＋)以及pET-32a(＋) 購自Novagen生物工程公司；pEASY-Blunt克隆試劑盒以及Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ、T4連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司（Takara）；Fast Pfu DNA聚合酶、DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒 DNA小量提取試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司。

剛地弓形蟲陽性DNA模板為本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR引物的合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1信號肽預(yù)測

于NCBI所公布的剛地弓形蟲ME49株全基因組信息中下載基因序列（＞NC_031476.1：2670839-2673590），其中CDS序列為1 119 bp。將此段CDS序列翻譯為對應(yīng)的氨基酸序列后利用信號肽預(yù)測軟件SignalP-5.0對的N端信號肽進(jìn)行分析。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)信號肽預(yù)測的結(jié)果，去除所預(yù)測的N端信號肽序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增截短序列的PCR引物，在上游和下游引物分別加入Ⅰ和Ⅰ的酶切位點(diǎn)（已用下劃線標(biāo)出），具體引物序列如下：

SRS29CF：5'-ATGGGGCCGCCGTACAGATACGAGCC-3'

SRS29CR：5'-ACCAATAGGCAAGTGCCGTCATCGC-3'

此后，按表1所示的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系配制，同時設(shè)陰性對照。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 μL

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30s；35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后72 ℃過延伸5min，最后置于15 ℃保溫。

PCR反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物取出，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3截短型基因片段回收

參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的說明書對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.2.4 克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut構(gòu)建

將回收的DNA片段直接與平末端克隆載體pEASY-Blunt連接，反應(yīng)體系見表2。

表2 連接反應(yīng)體系 μL

將反應(yīng)物混合均勻后置于PCR儀控溫25 ℃，反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后，取出離心管置于冰上，利用Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此后，于轉(zhuǎn)化后過夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落，接種于LB/Amp＋或LB/Kan＋的液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，此后用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系如表3，酶切完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果，將正確的克隆質(zhì)粒送至測序公司進(jìn)行基因序列測定。

表3 雙酶切反應(yīng)體系 μL

1.2.5 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a（＋）和pET-32a (＋)以及測序正確的克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt- SRS29Ccut分別用Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系見表3，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收pET-28a和pET-32a載體片段以及帶有Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的截短型基因片段，然后利用T4連接酶分別將pET-28a/SRS29Ccut以及pET-32a/SRS29Ccut于16℃連接過夜。連接體系如表4、表5所示。

表4 pET-28a/SRS29Ccut連接反應(yīng)體系 μL

表5 pET-32a/SRS29Ccut連接反應(yīng)體系 μL

連接反應(yīng)完成后分別將連接產(chǎn)物利用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此后，于轉(zhuǎn)化后過夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落，接種于LB/Kan＋（pET-28a/SRS29Ccut）或LB/Amp＋（pET-32a/ SRS29Ccut）的液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，此后用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系如表3，酶切完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果，確定構(gòu)建成功的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SRS29Ccut和pET-32a-SRS29Ccut。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 SRS29C信號肽預(yù)測結(jié)果

基因的CDS序列為1 119 bp，將此段CDS序列翻譯為對應(yīng)的氨基酸序列（共372個）后利用信號肽預(yù)測軟件SignalP-5.0對的N端信號肽進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果見圖1。

在圖1中，CS代表剪切位點(diǎn)的值，CS位點(diǎn)最高處代表信號肽剪切后的第一位氨基酸；SP代表信號肽區(qū)域，信號肽區(qū)域的SP值較高；OTHER代表綜合考慮CS值以及SP值的參數(shù)。根據(jù)圖1可知，氨基酸第52位為信號肽剪切后的第一位氨基酸，在第52位氨基酸之前，SP值較高。因此得出結(jié)論，的前51位氨基酸為信號肽區(qū)域，在后續(xù)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒的過程中應(yīng)該去除此段區(qū)域。因此后續(xù)截短型基因序列大小應(yīng)為1 119－51×3＝966 bp。

2.2 SRS29C截短型基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室保存的剛地弓形蟲DNA作為模板，利用設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物SRS29CF以及SRS29CR進(jìn)行截短型基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：與陰性對照相比，試驗(yàn)組在預(yù)測的目的基因大?。?66 bp）附近出現(xiàn)了一條明顯的條帶。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為截短型基因PCR產(chǎn)物；2為陰性對照

2.3 克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut的構(gòu)建

利用瓊脂糖凝膠電泳對構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，可以看到經(jīng)過雙酶切，克隆質(zhì)粒被切割成約966 bp的SRS29Ccut目的基因片段以及約3 929 bp的pEASY-Blunt克隆載體片段，說明已經(jīng)成功構(gòu)建克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4為克隆質(zhì)粒pEASY- Blunt-SRS29Ccut的雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將回收后的SRS29Ccut基因片段和pET-28a、pET-32a分別連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒pET-28a-SRS29Ccut的雙酶切結(jié)果如圖4所示，可以看到重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切反應(yīng)之后，在966 bp目的基因大小處以及pET-28a空載體5 300 bp左右的位置出現(xiàn)明顯的條帶，說明原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SRS29Ccut構(gòu)建成功。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-6為pET-28a-SRS29Ccut的雙酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pET-32a-SRS29Ccut的雙酶切結(jié)果如圖5所示，可以看到重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切反應(yīng)之后，在966 bp目的基因大小處以及pET-32a空載體5 900 bp左右的位置出現(xiàn)明顯的條帶，說明原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-SRS29Ccut構(gòu)建成功。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-6為pET-32a-SRS29Ccut的雙酶切鑒定結(jié)果

3 討論

剛地弓形蟲于1908年在北非突尼斯從梳趾鼠的肝、脾中首次發(fā)現(xiàn)，而在我國，于恩庶于1955年首次在貓和兔體內(nèi)分離出弓形蟲，謝天華于1962年報(bào)道了我國首例弓形蟲病[14]。一直以來弓形蟲隱性感染沒有引起人們的重視，其實(shí)隱性感染給人類帶來的危害也是十分嚴(yán)重的。弓形蟲的包囊在腦組織中長期存在可能會引起某些精神疾病。據(jù)國外資料，精神病患者弓形蟲的感染率在40.0%～50.0%左右，而在我國，精神病患者的弓形蟲感染率在8.0%～22.4%[15]。

目前已知的弓形蟲表面抗原被稱為表面抗原糖蛋白相關(guān)序列（Surface antigen glycoprotein 1-related sequences，SRSs），其均具有N端信號肽以及C端疏水區(qū)域，且多以糖基磷脂酰化（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）形式錨定在細(xì)胞膜上[10]。SRSs蛋白家族在弓形蟲生活史中發(fā)揮著重要的作用，主要表現(xiàn)在弓形蟲的識別、入侵、粘附、致病等過程。剛地弓形蟲（原名SRS2）與新孢子蟲的SRS2具有高度同源性[16]，據(jù)報(bào)道新孢子蟲的NcSRS2在新孢子蟲粘附及入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，且具有良好的免疫原性[17-19]，我們推測與新孢子蟲的NcSRS2具有高度同源性的弓形蟲SRS29C蛋白可能會在弓形蟲中發(fā)揮相似的作用，極具研究價(jià)值。

本試驗(yàn)選擇剛地弓形蟲作為研究對象，以期望為SRSs蛋白家族后續(xù)更深入的研究提供理論基礎(chǔ)或數(shù)據(jù)支持。由于在前期的試驗(yàn)當(dāng)中，將全長序列擴(kuò)增并嘗試進(jìn)行原核表達(dá)，在先后更換Transetta、BL21（plys）等感受態(tài)細(xì)胞后，原核表達(dá)始終無法得到理想結(jié)果。經(jīng)推測可能是由于序列中N端具有信號肽而影響了其原核表達(dá)，因此在本次試驗(yàn)中，經(jīng)過SignalP-5.0軟件分析后去除了N端51個氨基酸的信號肽區(qū)域，重新設(shè)計(jì)了引物，獲得了截短型基因并成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)深入研究剛地弓形蟲的生物學(xué)功能及免疫特性打下基礎(chǔ)。

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Cloning and construction of prokaryotic expression plasmid of truncatedgene of

Yuan Di1, Shao Yi1, Zhang Tongyao1, Jiang Fushan1, Li Xiurong2, Song Qiqi1,CorrespondingAuthor

（1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2.Agricultural and Animal Product Quality and Safety Center of Linhe district, Bayannaoer 015000, Inner Mongolia Autonomous Region, China）

In order to construct the prokaryotic expression plasmid ofgene, the signal peptide ofgene was predicted by using SignalP-5.0 software, the sequence of the signal peptide ofgene was removed, the truncated gene ofwas amplified and cloned, and then the prokaryotic expression plasmids were constructed.The results showed that the first 51 amino acids ofwere the signal peptide region, so by cutting off the signal peptide, the 966 bptruncated gene fragment (SRS29Ccut) was successfully obtained, and the recombinant plasmids pET-28a-SRS29Ccut and pET-32a-SRS29Ccut were successfully constructed.This study may lay a foundation for further study on the biological function and immune characteristics of the protein ofSRS29C.

;; truncated gene; prokaryotic expression plasmid

1008-5394（2021）03-0050-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.011

S855.9

A

2020-04-14

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（19JCQNJC13700）；天津市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（2018KJ185）；天津市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201803011）

袁娣（1997—），女，本科在讀，動物醫(yī)學(xué)專業(yè)。E-mail：yuandi1217@foxmail.com

宋淇淇（1986—），女，講師，博士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲學(xué)教學(xué)及研究工作。E-mail：qqs0606@163.com。

責(zé)任編輯：張愛婷