田 鑫，鐘 程，羅 歡，李雪飄

（凱里學院大健康學院，貴州凱里556011)

0 引言

野生大豆(Glycine soja Sieb.&Zucc.)是栽培大豆的近緣野生物種，屬于蝶形花科大豆屬一年生草本植物。野生大豆莖葉可作飼料，種子可食用，全株可入藥，是非常重要的野生資源，在農(nóng)牧業(yè)育種方面也凸顯重要作用[1]。野生大豆因其資源多、分布廣、蛋白含量高、品質(zhì)特異[2]，具有抗逆境脅迫的適應能力強、遺傳多樣性豐富，蘊藏著多種適應各種生態(tài)環(huán)境的獨特基因資源[3]。野生大豆對于豐富栽培大豆基因型、種質(zhì)資源創(chuàng)新及遺傳改良方面具有重要作用[4]。但因其粒小、蔓生、易裂莢等的特性一直未能充分開發(fā)利用，葉綠體是葉片光合作用中心，對干物質(zhì)的積累有重要影響，因此，光合參數(shù)直接影響作物產(chǎn)量[5]，生產(chǎn)上光合作用是影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的關鍵因素，光和能力強弱直接關系到產(chǎn)量和品質(zhì)的積累[6]，通過篩選高光合野生大豆材料是提高大豆光合效率的有效途徑。對于同一作物不同品種間或同一品種個體間的光和能力存在差異，Sakoda[7]研究了不同基因型大豆的光合能力，找出了其中光合能力強的品系14。關于大豆光合特性研究大多集中在栽培品種，遺傳基礎狹窄。近年來通過野生大豆改良大豆品種，已篩選出優(yōu)質(zhì)、抗性強的材料[8]。但是，關于野生大豆在光合特性方面的研究較少。主要研究關于野生大豆與栽培品種的雜交后代的光合變化[5,9]或野生大豆在逆境脅迫下對光合作用產(chǎn)生的影響[10]，除對野生大豆進行光合特性研究之外，在染色體核型上也有一定研究。Ahmad等[11]用數(shù)量統(tǒng)計方法分析得到野生大豆核型為2n=24m+14sm+2st。Ladizinsky等[12]發(fā)現(xiàn)大豆染色體C帶擁有4種不同帶型。鄭惠玉等[13]發(fā)現(xiàn)野生大豆染色體有4個隨體現(xiàn)象。鐘珍萍等[14]等發(fā)現(xiàn)3種野生大豆都含有1對最長染色體隨體。因此，野生大豆染色體帶型種類繁多，結(jié)合黔東南州野生大豆資源，開展該地區(qū)野生大豆染色體核型研究對深入系統(tǒng)開發(fā)和選育新種質(zhì)提供可靠的理論依據(jù)。本研究以前期收集到的兩份野生大豆為材料，通過光合指標的測定，比較不同類型的野生大豆的光合能力強弱，以期獲得較高光合能效的野生大豆材料，為后續(xù)的大豆遺傳改良提供方法和材料基礎。同時對根尖染色體核型進行比較，對挖掘作物的親緣關系和指導后續(xù)雜交育種具有重要意義，為物種進化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料于2017年12月在丁扒山和凱里學院收集獲得（由黔東南州林業(yè)局高級農(nóng)藝師王定江鑒定），于2018年3月12日播種于凱里學院實驗地，整個生長期進行常規(guī)管理。兩種野生大豆外觀形態(tài)差異表現(xiàn)為：丁扒山野生大豆（丁豆）的葉片橢圓、花期為10月上旬至11月上旬、花色為淡紫色、豆莢邊緣褐色絨毛、豆莢光滑；凱里學院野生大豆（凱豆）葉片為披針形、花期為8月中旬至9月下旬、花小且花色為紫色、豆莢附有褐色絨毛。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量測定方法 使用SPAD-502 Plus測定葉綠素含量，測定方法同光合特性測定。

1.2.2 各生育期光合特性測定 根據(jù)Fehr等[15]提出的大豆生育期鑒定方法，研究其營養(yǎng)期25節(jié)期(V25)、盛花期(R3)、結(jié)莢期(R5)3個時期，每個時期于晴天上午8:00—18:00選擇生長健壯、長勢一致且無病蟲害植株各3株，在各株的同一部位和同一方向選取3片葉進行測定，重復3次取平均值。每隔2 h測定一次，待數(shù)值穩(wěn)定后記錄其凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、光強(Par)。

1.2.3 光響應曲線的測定方法 光響應曲線測定采用LI-6400XT紅藍光源。測定時間為9:00—14:00，光合有效輻射梯度為2000、1600、1200、800、400、200、100、50、20、0 μmol/(m2·s)。每次測定前矯正 15～ 20 min。CO2濃度為 500 μmol/(m2·s)，記錄 Pn、Ci、Gs、Tr等指標。用葉子飄等[116]提出的修正模型對曲線進行擬合。

1.2.4 根尖染色體處理 于8:00—9:00選取長勢良好粗壯無病蟲害的根尖，采用AEG法進行處理[17-18]。選取乳白色根尖1 mm左右進行展開壓平，用Giemsa染液染色10～ 15 min，烤片1～ 2 min，在OLYMPUS-BX53熒光顯微鏡觀察拍照。核型類型劃分及核型不對稱系數(shù)計算分別參照李懋學[17]和Arano[18]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析及圖片制作 采用SPSS 23軟件進行數(shù)據(jù)分析，用DPS進行光合擬合，Photoshop完成作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期葉綠素含量的變化

由圖1可知，兩種野生大豆在營養(yǎng)期(V25)的差異不顯著，在盛花期和結(jié)莢期凱豆的葉綠素含量顯著高于丁豆。且同種野生大豆的不同時期葉綠素含量也存在顯著差異。丁豆營養(yǎng)期與盛花期差異不顯著，結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期，盛花期和結(jié)莢期差異不顯著；凱豆的營養(yǎng)期與盛花期、結(jié)莢期差異顯著，但盛花期和結(jié)莢期無顯著差異且顯著高于營養(yǎng)期。

圖1 兩種野生大豆葉綠素含量比較

2.2 光合速率日變化

由圖2可知，丁豆結(jié)莢期呈先上升后下降的趨勢，營養(yǎng)期和盛花期呈下降趨勢。凱豆營養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期光合速率均呈先上升后下降的趨勢，凱豆3個時期光合速率在10:00時出現(xiàn)峰值，丁豆營養(yǎng)期光合速率在10:00時出現(xiàn)峰值。兩種野生大豆在同一時間的光合速率差異顯著。在早上8:00時，丁豆營養(yǎng)期與盛花期無顯著差異，營養(yǎng)期和盛花期與結(jié)莢期差異顯著，營養(yǎng)期>結(jié)莢期，凱豆結(jié)莢期、營養(yǎng)期、盛花期的光合速率間差異顯著，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，且凱豆光合速率顯著高于丁豆光合速率。當10:00時，凱豆光合速率顯著高于丁豆光合速率，凱豆營養(yǎng)期與結(jié)莢期差異顯著，且結(jié)莢期>營養(yǎng)期，營養(yǎng)期與盛花期差異不顯著，盛花期與結(jié)莢期差異不顯著。丁豆3個時期間差異不顯著。當12:00時，凱豆的3個時期光合速率顯著高于丁豆的光合速率，丁豆的盛花期顯著高于營養(yǎng)期和結(jié)莢期。當14:00時，凱豆3個時期差異顯著，丁豆盛花期高于營養(yǎng)期和結(jié)莢期。在16:00時，凱豆和丁豆的盛花期與結(jié)莢期差異不顯著，但兩者與營養(yǎng)期差異顯著。在18:00時，丁豆的盛花期與結(jié)莢期差異不顯著，兩個時期與營養(yǎng)期差異顯著。凱豆的3個時期間均存在顯著差異，且盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。

圖2 兩種野生大豆光合速率比較

2.3 氣孔導度日變化

由圖3可知，凱豆結(jié)莢期氣孔導度呈下降趨勢，營養(yǎng)期和盛花期呈單峰曲線，在10:00時出現(xiàn)峰值。丁豆的營養(yǎng)期氣孔導度呈下降趨勢，盛花期和結(jié)莢期呈單峰曲線，在10:00時盛花期出現(xiàn)峰值，在12:00時結(jié)莢期出現(xiàn)峰值。在8:00—18:00時，凱豆結(jié)莢期顯著高于盛花期和營養(yǎng)期，氣孔導度大小為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期。在8:00時，凱豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，同時也顯著高于丁豆3個時期，丁豆營養(yǎng)期顯著高于盛花期和結(jié)莢期。在10:00時，凱豆3個時期存在顯著差異，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，丁豆3個時期差異不顯著，凱豆3個時期均顯著高于丁豆。在12:00—14:00時，凱豆3個時期差異顯著，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，丁豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，營養(yǎng)期和盛花期差異不顯著，其中，凱豆盛花期和結(jié)莢期顯著高于丁豆結(jié)莢期和盛花期。在18:00時，凱豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期。

圖3 兩種野生大豆氣孔導度比較

2.4 胞間CO2濃度日變化

由圖4可知，凱豆結(jié)莢期的胞間CO2濃度呈下降趨勢，營養(yǎng)期和盛花期的胞間CO2濃度呈先下降后上升的趨勢。丁豆營養(yǎng)期呈先下降后上升再下降的趨勢，其盛花期呈下降趨勢，結(jié)莢期呈雙峰曲線。同時，在8:00時，凱豆3個時期均大于丁豆3個時期，兩種野生大豆胞間CO2濃度均為營養(yǎng)期>盛花期>結(jié)莢期。在10:00時，凱豆盛花期和結(jié)莢期均大于丁豆盛花期和結(jié)莢期；凱豆胞間CO2濃度差異顯著，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期；丁豆營養(yǎng)期和結(jié)莢期差異不顯著，營養(yǎng)期和結(jié)莢期顯著高于盛花期。在12:00時，凱豆盛花期和結(jié)莢期均大于丁豆盛花期和結(jié)莢期，其結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，丁豆胞間CO2濃度為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期。在14:00時，凱豆3個時期的胞間CO2濃度均大于丁豆3個時期，其大小為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期，丁豆大小為營養(yǎng)期>盛花期>結(jié)莢期。在16:00時，丁豆大小為營養(yǎng)期>盛花期>結(jié)莢期，凱豆營養(yǎng)期和盛花期顯著高于結(jié)莢期。在18:00時，凱豆營養(yǎng)期顯著高于盛花期和結(jié)莢期，丁豆大小為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期。

圖4 兩種野生大豆胞間CO2濃度比較

2.5 蒸騰速率日變化

由圖5可知，兩種野生大豆蒸騰速率均呈先上升后下降的趨勢，凱豆盛花期和結(jié)莢期在14:00時達到峰值，營養(yǎng)期在12:00時出現(xiàn)峰值。在12:00時丁豆營養(yǎng)期和盛花期蒸騰速率最高，在14:00時結(jié)莢期蒸騰速率最大。在8:00時，丁豆結(jié)莢期顯著高于凱豆，丁豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，凱豆盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。在10:00時，丁豆盛花期顯著低于凱豆，凱豆大小為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，丁豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期。在12:00時，凱豆盛花期顯著高于丁豆盛花期，其盛花期和結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期，丁豆結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期。在14:00時，凱豆3個時期顯著高于丁豆3個時期，兩種野生大豆蒸騰速率均為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期。在16:00時，兩種野生大豆蒸騰速率均為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。在18:00時，丁豆大小為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期，凱豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期。

圖5 兩種野生大豆蒸騰速率比較

2.6 光響應曲線

從表1可知，丁豆營養(yǎng)期在0～ 1200 μmol/(m2·s)范圍內(nèi)的光合速率呈上升趨勢，在1200～ 2000 μmol/(m2·s)呈下降趨勢；丁豆盛花期和結(jié)莢期在0～ 1600 μmol/(m2·s)范圍內(nèi)的光合速率呈上升趨勢，在1600～ 2000μmol/(m2·s)范圍內(nèi)呈下降趨勢。在0～ 100 μmol/(m2·s)范圍內(nèi)的光合速率為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期。凱豆的光合速率隨著光照強度的變化而變化，光照強度越強，光合速率越大，但隨著光照強度的增大，光合速率受到抑制，開始呈下降趨勢。光照強度在 2000 μmol/(m2·s)，營養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期的光合速率均小于1600 μmol/(m2·s)時的光合速率。

表1 兩種野生大豆光響應曲線比較

由圖6a可知，丁豆光合速率為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期，在光照強度為 1600 μmol/(m2·s)均有光抑制現(xiàn)象。由圖6b可知，凱豆光合速率大小盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。營養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期的光合速率均呈上升趨勢，但在光照強度為2000 μmol/(m2·s)時，3個時期的光合速率均小于光照強度為1600 μmol/(m2·s)的光合速率。

將兩種野生大豆的營養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期3個時期進行DPS數(shù)據(jù)擬合，并計算其光補償點(LCP)、光飽和點(LSP)、最大凈光合速率(Pmax)。通過DPS 7.05擬合得出相應的擬合值及參數(shù)，將對應的擬合值作圖及擬合出的參數(shù)分別帶入式(2)、(3)、(4)計算出LCP、LSP、Pmax結(jié)果如表2所示。

表2 營養(yǎng)期、盛花期及結(jié)莢期的LCP、LSP、Pmax、Rd

結(jié)合圖6和表3可知，當光照強度大于光飽和點時的光照強度時，野生大豆受到光抑制現(xiàn)象；當光照強度小于光補償點時，野生大豆無法正常光合作用，只能進行暗呼吸。凱豆LCP、LSP、Pmax均為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。丁豆Rd為結(jié)莢期>營養(yǎng)期>盛花期，凱豆Rd為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期；丁豆LCP為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，LSP和Pmax為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。

圖6 丁豆(a)及凱豆(b)光響應擬合修正的直角雙曲線模型

通過對野生大豆染色體中期分裂細胞的仔細篩選，挑選出染色體分散情況良好、染色體的數(shù)目完整、形態(tài)清晰的高質(zhì)量染色體照片，且對所得到的染色體進行測量及分析，從而得到染色體的相關參數(shù)表（表3），根據(jù)染色體參數(shù)（染色體數(shù)、臂比值、不對稱系數(shù)）可得出野生種的類型。其相關參數(shù)內(nèi)容包括染色體數(shù)，染色體臂比，類型，及染色體形態(tài)圖（圖7）。兙俥

根據(jù)染色體不同形態(tài)圖（圖7）及染色體核型參數(shù)表3可得出，野生大豆的染色體數(shù)目都為2n=2x=40，從染色體數(shù)目、臂比、不對稱系數(shù)、最長染色體/最短染色體進行分析得出2個野生種的核型公式2n=22m+16sm+2st，2n=24m+12sm+4st，丁豆和凱豆的核型參數(shù)存在差異，其不對稱系數(shù)分別為61.93%、64.31%，兩種野生大豆共有24條染色體為中部著絲粒染色體，14條為近中部著絲粒染色體，2條為端部著絲粒染色體。環(huán)境差異越大，不對稱系數(shù)差異越大，兩種野生大豆的不對稱系數(shù)差異不大，因此，兩種大豆的生境條件相近。

表3 野生大豆核型比較

圖7 兩種野生大豆染色體形態(tài)圖

3 討論與結(jié)論

野生大豆光合速率日變化呈雙峰曲線，存在“光合午休”現(xiàn)象，是野生大豆自身對正午強光和高溫等環(huán)境因素的適應力，氣孔導度和胞間CO2濃度影響植物光合作用和蒸騰作用，兩種野生大豆出現(xiàn)午休現(xiàn)象之后，光合速率均呈下降趨勢。引起光合午休現(xiàn)象的因素主要有生態(tài)因子、生理因子和生化因子[21]，生態(tài)因子是外部因素[22]（包括溫、光、水、氣、肥等的影響），植物本身是受氣孔和非氣孔因素影響，非氣孔因素受葉片自身因素、葉綠素含量、光合酶活性變化的影響[23]，這與吳廷娟[24]的研究結(jié)果一致，本研究主要受氣孔因素影響，由于野生大豆葉片出現(xiàn)反卷現(xiàn)象，胞間CO2濃度降低，導致光合速率降低。當光強超過光飽和點之后，發(fā)生光抑制現(xiàn)象，消耗掉自身制造的有機物。本研究得出，兩種野生大豆的光飽和點(LSP)為1067.6232～ 2000.0000 μmol/(m2·s)，光 補 償 點 (LCP)為 8.5143～ 18.1563 μmol/(m2·s)，兩種野生大豆的LSP較高，LCP較低，而陰生植物的LSP在50～ 1000 μmol/(m2·s)，LCP在 20 μmol/(m2·s)[25]，可見，這兩種野生大豆是耐陰植物，凱豆的LSP>丁豆，凱豆屬高光效植物，丁豆LCP為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)時期，LSP為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)時期；凱豆LCP、LSP均為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)時期。兩種野生大豆在盛花期的光合效能最高，有利于有機物積累，Pmax在 7.8613～ 19.2078 μmol/(m2·s)，凱豆的羧化效率較高，光合電子傳遞活性高，因此對CO2的同化效率高，與LSP的結(jié)果一致，光響應曲線擬合的結(jié)果均符合修正的直角雙曲線模型與索榮臻等[9]研究結(jié)果一致。

野生大豆的染色體數(shù)目均為2n=2x=40的二倍體這與壽惠霞等[26]結(jié)論一致。兩種野生大豆不對稱系數(shù)較大，染色體較不對稱這與鐘珍萍等[27]研究一致。丁豆核型為2B型，凱豆為2C這與王建波等[28]研究存在差異，可能是不同野生種，同時還受地理環(huán)境的影響。需在后續(xù)的實驗中進行基因鑒定，判斷是否與王建波的野生大豆是不同種才能確定產(chǎn)生差異的原因。

葉片光合能力的強弱與葉綠素含量有關[29-30]；植株的葉綠素含量越高，葉片光合能力越強，本研究發(fā)現(xiàn)凱豆的葉綠素含量較丁豆高，凱豆的光合速率、氣孔導度、胞間CO2、蒸騰速率均高于丁豆，因此光和能力較強，光能利用率高。