彭 華，宋 霞，張 春

（1四川旅游學(xué)院旅游文化產(chǎn)業(yè)學(xué)院，成都610100；2四川旅游學(xué)院旅游農(nóng)業(yè)發(fā)展研究中心，成都610100；3西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000）

0 引言

蘿卜(Raphanus sativusL.)屬于十字花科蘿卜屬植物，是一年生或二年生植物，在中國分布廣泛，種類繁多[1]?！僦}卜’是重慶市涪陵區(qū)兩江交匯處特有的地方蘿卜品種，據(jù)記載已有100多年的歷史，它的肉質(zhì)根和根皮均為深紅色，富含蘿卜紅色素，是提取天然紅色素的好原料[2]。蘿卜紅色素的主要成分為天竺葵素的葡萄糖酐衍生物，為花色素苷類物質(zhì)，其水溶液最大吸收波長在530 nm處[3-4]。蘿卜紅色素具有純天然無毒害、生產(chǎn)成本低、周期短、來源豐富以及有一定的營養(yǎng)和藥效價(jià)值等特點(diǎn)，適合用于食品、醫(yī)療、美妝、服裝等行業(yè)的添加劑和染色劑，是中國規(guī)定可以使用的天然食用色素之一[5-9]。

目前關(guān)于蘿卜紅色素的研究主要集中在色素提取工藝、分子合成機(jī)制及理化性質(zhì)等方面[10-11]。在紅色素提取方面，研究表明蘿卜紅色素易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，在溫度大于60℃和陽光照射下穩(wěn)定性會(huì)降低，而酸性條件下穩(wěn)定性較高[12-14]。除常規(guī)浸提法外，超臨界CO2萃取法[15]、微波提取法[16]和超聲波輔助法[17]等輔助方法的運(yùn)用能夠一定程度的提高蘿卜紅色素得率。前人曾經(jīng)嘗試提取‘涪陵胭脂蘿卜’紅色素，但由于條件有限，制得的產(chǎn)物易結(jié)塊且蘿卜氣味較大[17]。目前的研究主要集中于提高蘿卜紅色素的穩(wěn)定性以及有效的去除蘿卜味，對(duì)‘胭脂蘿卜’提取工藝系統(tǒng)化及比較分析研究較少[18]。在提取工藝優(yōu)化的研究中運(yùn)用乙醇、乙酸等單一溶劑較多[19-21]，而多種溶劑配合運(yùn)用的研究較少，因此，胭脂蘿卜紅色素提取工藝優(yōu)化的研究值得進(jìn)一步深入。

本研究采用超聲波輔助提取法提取‘胭脂蘿卜’紅色素，研究了乙醇、鹽酸、丙酮和鹽酸-丙酮復(fù)合溶液提取劑、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)‘胭脂蘿卜’紅色素吸光值的影響，并對(duì)幾個(gè)蘿卜種質(zhì)的紅色素提取液吸光值進(jìn)行了比較研究，為‘胭脂蘿卜’紅色素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選用了7個(gè)不同肉質(zhì)顏色的蘿卜，分別為‘野生蘿卜’、‘西昌白蘿卜’、‘大紅袍’、‘紅心 1 號(hào)’、‘胭脂紅1號(hào)’、‘胭脂紅2號(hào)’和‘罐罐蘿卜’。其中‘胭脂紅2號(hào)’用于紅色素提取工藝優(yōu)化研究。試驗(yàn)于2019年12月—2020年5月在四川旅游學(xué)院烹飪科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

濃鹽酸、無水乙醇、丙酮等均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠。試驗(yàn)主要使用的化學(xué)儀器列于表1。

表1 試驗(yàn)主要儀器

1.3 蘿卜紅色素提取、測定流程

取‘胭脂紅2號(hào)’肉質(zhì)根洗凈，切成厚約1 mm的薄片，烘干至恒重后粉碎，制得胭脂蘿卜干碎片。準(zhǔn)確稱取1.000 g的上述碎片置于離心管中，量取一定量的提取液，放入超聲波清洗機(jī)中在一定溫度條件下浸提一定時(shí)間，將浸提液于3000 r/min離心3 min，取上清定容至25 mL，于波長530 nm下測定吸光值。

1.4 提取液的選擇

提取液分別為乙醇和丙酮的體積分?jǐn)?shù)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%水溶液，鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.6%、7.2%、10.8%、14.4%、18.0%、21.6%、25.2%、28.8%、32.4%、36.0%水溶液。以上述溶液為提取液，超聲浸提條件為50℃浸提20 min，采用1.3所述流程進(jìn)行色素提取并測定吸光值。

1.5 提取條件的選擇

研究料液比、提取溫度、超聲頻率對(duì)‘胭脂蘿卜’紅色素提取率的影響，首先做單因素試驗(yàn)考察以上條件對(duì)提取率的影響，然后采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化最佳工藝條件。

1.5.1 提取液配比的選擇 將10.8%的鹽酸溶液和30%丙酮溶液配制成比例分別為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的溶液作為提取液，取10 mL加入離心管中，稱取蘿卜碎片1.000 g加入離心管，超聲浸提條件為50℃浸提20 min，按1.3中結(jié)所述流程提取色素并測量吸光值，重復(fù)3次。

1.5.2 料液比的選擇 稱取蘿卜碎片1.000 g，取1.5.1中研究所得的最適提取液2 mL（料液比1:2 g/mL），4 mL（料液比1:4 g/mL），6 mL（料液比1:6 g/mL），8 mL（料液比1:8 g/mL），10 mL（料液比1:10 g/mL），12 mL（料液比1:12 g/mL）加入離心管，超聲浸提條件為50℃浸提20 min，按1.3小節(jié)所述流程提取色素、定容并測量吸光值，重復(fù)3次。

1.5.3 提取溫度的選擇 取1.5.1中所得的最適提取液10 mL加入離心管中，稱取蘿卜碎片1.000 g加入離心管，設(shè)置提取溫度為20、30、40、50、60℃，浸提20 min，按1.3中所述流程提取色素并測量吸光值，重復(fù)3次。

1.5.4 提取時(shí)間的選擇 取1.5.1中所得的最適提取液10 mL加入離心管中，稱取蘿卜碎片1.000 g加入離心管，設(shè)置提取時(shí)間為20、40、60、80、100 min，超聲浸提條件為50℃，按1.3中所述流程提取色素并測量吸光值，重復(fù)3次。

1.5.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了獲得提取蘿卜紅色素的最佳工藝條件，采用正交設(shè)計(jì)法，選用正交設(shè)計(jì)表L16(45)進(jìn)行表頭設(shè)計(jì)，共設(shè)3個(gè)因素，分別為提取液配比、料液比、提取溫度。按各試驗(yàn)號(hào)依次完成試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)設(shè)3次重復(fù)，以3次重復(fù)的吸光值進(jìn)行正交分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 356進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理和作圖，利用DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取液的選擇 乙醇浸提從0%～ 30%呈上升趨勢(shì)，30%～ 100%呈下降趨勢(shì)，因此，乙醇溶液浸提蘿卜紅色素的最適濃度為30%。鹽酸浸提從0%～ 3.6%呈上升趨勢(shì)，但3.6%～ 36.0%之間只有輕微變化，因此確定鹽酸提取蘿卜紅色素的最適濃度為3.6%。丙酮浸提從0%～ 30%呈上升趨勢(shì)，30%～ 100%呈下降趨勢(shì)，因此丙酮浸提蘿卜紅色素的最適濃度為30%（圖1）。3種溶劑浸提蘿卜紅色素效果的順序?yàn)椋蝴}酸＞丙酮＞乙醇，其中鹽酸濃度為10.8%時(shí)吸光值最高，為2.054，乙醇和丙酮濃度為30%時(shí)吸光值最高，分別為1.428和1.105。

圖1 不同濃度鹽酸、乙醇和丙酮對(duì)蘿卜紅色素提取液吸光值的影響

2.1.2 提取液配比的選擇 為了進(jìn)一步提高提取率，嘗試將濃度均為10.8%的鹽酸溶液和30%的丙酮溶液按比例1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1配置成提取液進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同鹽酸和丙酮溶液的比例在1:9到5:5的過程中提取效率越來越高，在5:5到9:1的過程中，吸光值依次下降，所以我們可以得到浸提蘿卜紅色素效果最適比例為5:5（圖2）。并且高于單獨(dú)使用鹽酸或丙酮。故選定3:7、4:6、5:5、6:4為正交試驗(yàn)的4個(gè)水平。

圖2 提取液配比對(duì)吸光值的影響

2.1.3 料液比的選擇 溶劑的用量過低，因蘿卜紅色素飽和而提取不完全，導(dǎo)致提取率偏低；溶劑用量過大，提取液中有效成分的濃度降低，導(dǎo)致提取效率降低，還會(huì)造成溶劑的浪費(fèi)[23-24]。在控制時(shí)間和浸提溫度不變的條件下，考察不同料液比對(duì)浸提蘿卜紅色素的影響，料液比從1:2降低到1:6的過程中提取液的吸光值增加，從1:6降低到1:12的過程中，提取液的吸光值逐漸減少（圖3）。料液比在1:6時(shí)浸提到的蘿卜紅色素含量最高，故選定1:4、1:6、1:8、1:10 g/mL為正交試驗(yàn)料液比的4個(gè)水平。

圖3 料液比對(duì)吸光值的影響

2.1.4 提取溫度的選擇 溫度對(duì)提取率的影響主要有2方面，一方面能提高色素在提取液中的溶解度，另一方面高溫下色素自身分解，鹽酸和丙酮會(huì)加速揮發(fā)，從而降低色素在提取液中的溶解度[25]。由圖4可知，隨著提取溫度的提高，提取率呈先增大再持平后減小的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，提取率較高，60℃時(shí)提取率下降。因此，選定30、40、50、60℃為正交試驗(yàn)提取溫度的4個(gè)水平。

圖4 提取溫度對(duì)吸光值的影響

2.1.5 提取時(shí)間的選擇 考察提取時(shí)間對(duì)浸提液吸光值的影響，結(jié)果表明浸提的時(shí)間從20～ 100 min的過程中，吸光值呈下降趨勢(shì)，說明紅色素溶于鹽酸丙酮溶液的速度很快，20 min已經(jīng)能夠達(dá)到最大值。從20～ 60 min的過程中，下降的較為明顯，60～ 100 min變化不太明顯（圖5）。降低的原因可能是提取時(shí)間過長增加鹽酸和丙酮蒸發(fā)，從而降低色素在提取液中的溶解度。由數(shù)據(jù)分析可得出蘿卜紅色素浸提的最適時(shí)間為20 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)吸光值的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取試驗(yàn)提取液配比、料液比、提取溫度等3項(xiàng)因素中有意義的水平確定正交試驗(yàn)方案（表2）。試驗(yàn)完成后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，計(jì)算各因素平均值和極差，以確定最佳的提取條件。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果列于表3～ 表5。由表3方差分析表明，提取液配比對(duì)吸光值影響達(dá)顯著水平，料液比、提取溫度和料液比×溫度互作對(duì)吸光值影響達(dá)極顯著水平，而料液比×提取液配比互作對(duì)吸光值的影響不顯著。因此，有必要對(duì)料液比、提取溫度、提取液配比和料液比×溫度互作進(jìn)行因素內(nèi)多重比較。同因素中不同水平的結(jié)果均值反映了不同水平在該因素中對(duì)結(jié)果的影響，極差的大小反映了該因素的變化對(duì)結(jié)果影響的大小，由此可見對(duì)吸光值的影響從大到小依次為提取溫度、料液比、料液比×溫度互作和提取液配比。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2.2.1 料液比對(duì)吸光值的影響 料液比的極差分析結(jié)果在5個(gè)因素中居第2位，因此，試驗(yàn)中優(yōu)化料液比是保證高提取率的重要因素。表4顯示，當(dāng)料液比為水平3即1:8時(shí)吸光值最大，因素內(nèi)的多重比較表明，水平3（料液比=1:8）與水平2（料液比=1:6）達(dá)顯著差異，與水平4（料液比=1:10）和水平1（料液比=1:4）差異達(dá)極顯著水平。因此料液比選擇水平3（料液比=1:8）為宜。.

2.2.2 提取溫度對(duì)吸光值的影響 提取溫度的極差分析結(jié)果在5個(gè)因素中居第1位，因此，試驗(yàn)中優(yōu)化提取溫度是保證高提取率的首要因素。表4顯示，當(dāng)提取溫度為水平3即50℃時(shí)吸光值最大，因素內(nèi)的多重比較表明，水平3與其他水平相比均達(dá)極顯著差異，因此50℃是提取溫度的最佳選擇。此外，正交分析結(jié)果表明料液比×溫度互作對(duì)吸光值的影響極顯著，可能是由于溫度影響了紅色素的溶解度，在高料液比的情況下，溶液飽和后溫度越高，紅色素溶解度越高，從而吸光值越高。二者互作的極差分析結(jié)果在5個(gè)因素中居第3位，對(duì)吸光值的影響低于提取溫度和料液比，因此不必考慮兩者互作對(duì)最優(yōu)提取條件的影響。

表4 因素均值表

2.2.3 提取液配比對(duì)吸光值的影響 由表5可知，鹽酸丙酮提取液配比和料液比×提取液配比互作的極差在5個(gè)因素中是最小的2個(gè)，比另外3個(gè)因素少了1個(gè)數(shù)量級(jí)，說明酸化丙酮提取液配比和料液比×提取液配比互作對(duì)吸光值的影響是5個(gè)因素中最小的。由表4可知，提取液配比的4個(gè)水平中，水平3即鹽酸：丙酮=5:5的吸光值是最大的，因素內(nèi)的多重比較表明，水平3和水平2（鹽酸：丙酮=4:6）、水平 4（鹽酸：丙酮=6:4）差異不顯著，和水平1（鹽酸：丙酮=3:7）差異顯著。因此，10.8%鹽酸：30%丙酮=6:4、4:6和5:5均可作為提取液配比的配方。

表5 因素極差表

綜上，提取‘胭脂蘿卜’紅色素的條件可優(yōu)化為：提取料液比取1:8，提取溫度取50℃，提取液選用鹽酸丙酮提取液，其配比為10.8%的鹽酸:30%的丙酮=1:1，提取時(shí)間選20 min。但這個(gè)處理組合不在正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，故進(jìn)一步以該組合做補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，3次重復(fù)的平均吸光值為2.311，高于正交試驗(yàn)中吸光值最高的7號(hào)處理，證實(shí)了試驗(yàn)得出的理想組合確實(shí)是最佳組合。

2.3 不同顏色蘿卜紅色素含量

用優(yōu)化后的方法提取并比較了7個(gè)蘿卜品種蘿卜根皮和蘿卜肉質(zhì)根的紅色素提取液的吸光值。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，各材料間的吸光值存在顯著或極顯著差異，且吸光值和蘿卜顏色關(guān)系密切，即目測顏色較深的蘿卜，吸光值也較大，白蘿卜的吸光值最低（表6）。此外，數(shù)據(jù)表明蘿卜根皮的吸光值高于蘿卜肉質(zhì)根的吸光值，說明蘿卜根皮的紅色素含量高于肉質(zhì)根。

表6 不同蘿卜品種紅色素提取液吸光值

3 結(jié)論與討論

浸提法是蘿卜紅色素的主要獲取方法之一，蘿卜紅色素在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性且易溶于極性分子，采用浸提法提取蘿卜紅色素常用的溶劑主要有乙酸、水、檸檬酸、乙醇等極性和酸性溶劑，最高產(chǎn)率能達(dá)到3%左右[26]。本研究在前人對(duì)各種溶劑篩選的基礎(chǔ)上，試圖通過復(fù)合溶劑進(jìn)一步提高蘿卜紅色素的提取率，結(jié)果表明在本研究條件下，鹽酸丙酮復(fù)合溶劑所得的紅色素提取液的吸光值高于僅用鹽酸或丙酮的吸光值。前人研究表明，復(fù)合溶液提取可以獲得更高的提取率，張晶晶[27]研究發(fā)現(xiàn)0.15 mol/L鹽酸-65%乙醇復(fù)合溶劑提取彩葉草色素的效果最佳，于開源等[28]研究表明乙醇:水:石油醚=1:2:6混合溶劑是提取南瓜β-胡蘿卜色素的最優(yōu)溶劑，本研究結(jié)果說明蘿卜紅色素提取率可以通過復(fù)合溶劑得到進(jìn)一步提高，這是對(duì)前人研究結(jié)果在蘿卜紅色素提取上的擴(kuò)展，也為進(jìn)一步提高蘿卜紅色素提取的效率提供了參考。熊勇等[14]以檸檬酸溶液為溶劑，提出蘿卜紅色素最佳提取工藝條件為：提取溫度為43.07℃、提取pH 2.88、提取時(shí)間為3.65 h、料液比為1:4，在此條件下提取率為65.21%。閆亞茹等[29]通過熱水浸提法篩選提取蘿卜紅色素的最佳條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溫度達(dá)到65℃、提取時(shí)間100 min、提取料液比為35:1時(shí)，提取的效率最高，三者對(duì)蘿卜紅色素的提取效率影響力度為提取時(shí)間＞提取料液比＞提取溫度。本研究結(jié)果表明，提取液配比對(duì)吸光值影響達(dá)顯著水平，料液比、提取溫度對(duì)吸光值影響達(dá)極顯著水平，對(duì)吸光值的影響從大到小依次為提取溫度、料液比和提取液配比。在提取料液比取1:8，提取溫度取50℃，提取液選用鹽酸丙酮提取液，其配比為10.8%的鹽酸:30%的丙酮=1:1，提取時(shí)間選20 min的條件下，紅色素提取液吸光值最高，但由于與前人研究所用蘿卜原材料和提取溶劑不盡一致，故本研究與前人所得結(jié)論存在一定差異。

本研究還利用優(yōu)化后的提取工藝對(duì)紅心蘿卜種質(zhì)資源進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)7份蘿卜種質(zhì)中以‘胭脂紅2號(hào)’色素含量最高，蘿卜根皮的色素含量比肉質(zhì)根更高，該結(jié)果為蘿卜紅色素進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。