陳奕鶴，馬立文，殷旭峰，吳 迪，駱 丹*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇 南京 210029；2南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院皮膚科，江蘇 南京 210008

惡性黑素瘤是一種高度惡性的腫瘤，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，近年來黑素瘤的發(fā)病率和病死率日益增加，并呈現(xiàn)出年輕化趨勢，盡管它的發(fā)病只占皮膚腫瘤的4%，但死亡人數(shù)卻占75%［1］。WNT 信號通路在胚胎發(fā)育、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和再生中起著重要作用［2］，其功能異常與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，包括胚胎畸形、退行性疾病和腫瘤發(fā)生［3-4］。WNT 信號通路被分為兩種主要途徑，包括β-catenin 依賴性途徑和β-catenin非依賴性途徑，前者被稱為經(jīng)典途徑或WNT/β-catenin途徑，而后者被稱為非經(jīng)典途徑［5］。人類WNT家族由19 種不同的富含半胱氨酸的糖蛋白組成，一般來說WNT1、WNT2、WNT3、WNT3a、WNT8a、WNT8b、WNT10a和WNT10b是經(jīng)典途徑的激活劑，而WNT4、WNT5a、WNT5B、WNT6、WNT7a、WNT7b 和Wnt11 是非經(jīng)典WNT 信號的常見激活劑，但也有研究表明，經(jīng)典和非經(jīng)典WNT 通路之間可能存在串?dāng)_［6］。報道證實WNT7b 在前列腺癌中高表達［7］，在高分化乳腺癌中的表達也明顯高于低分化乳腺癌，且其高表達可作為判斷乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志［8］；WNT7b還可以作為胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生發(fā)展中Wnt/β-catenin 信號通路差異激活的主要決定因子［9］；miR-505通過直接靶向抑制WNT7b而使Wnt/β-catenin信號通路失活［10］。然而WNT7b在黑素瘤中還未有深入研究。本研究探討了WNT7b 在黑素瘤細胞中的表達情況，以及敲低WNT7b對人源黑素瘤細胞系A(chǔ)375分子生物學(xué)行為的影響，進而初步探討WNT7b在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為黑素瘤的靶向治療提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM 培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國），胎牛血清（杭州四季清公司），胰蛋白酶-EDTA消化液、雙抗、RIPA 蛋白裂解液、BCA 試劑盒（上海碧云天公司），細胞周期檢測試劑盒（上海聯(lián)科生物），siRNA、riboFECTTM CP reagent（廣州銳博生物），TRIzol（Invitrogen 公司，美國），SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems 公司，美國）；WNT7b抗體（Abcam公司，美國），GAPDH、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國），Cyclin E1、Cyclin D1、c-MYC、Snail1、FOXC2、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2、MMP-3、MMP-7 抗體（Proteintech 公司，美國），MMP-9抗體（Affbiotech公司，美國），羊抗鼠、羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（Olympus 公司，日本），實時定量PCR 儀（ABI 公司，美國），流式細胞分析儀（Becton-Dickinson 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

A375、SK-MEL-28、A875 細胞系由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所病理實驗室贈送；A375、A875 細胞使用含有1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，SK-MEL-28 細胞使用含有1%雙抗、10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。實驗分為空載組（NC組）與實驗組（WNT76-siRNA組），轉(zhuǎn)染前24 h消化收集細胞并計數(shù)，按1×105個/孔鋪于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細胞覆蓋率達70%時進行轉(zhuǎn)染（依照riboFECTTM CP reagent說明書），培養(yǎng)48 h后提取總RNA與總蛋白。敲低WNT7b的siRNA序列為5′-CAGACCTGGTGTACATTGA-3′。

1.2.2 RNA提取與qRT-PCR

用TRIzol 試劑提取細胞總RNA 并進行濃度測定，RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，使用SYBR Green Master Mix 的RT-PCR擴增cDNA并檢測，最后根據(jù)PCR反應(yīng)曲線記錄的Ct值計算2-ΔΔCt值。引物設(shè)計見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Seguences of qRT-PCR primers

1.2.3 Western blot檢測

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白分析試劑盒測量蛋白濃度后加適量上樣緩沖液100 ℃煮沸5 min 使其變性。每孔取蛋白提取物20 μg通過SDS凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含有5%脫脂奶粉溶液的TBS-T封閉1 h；4 ℃孵育一抗過夜；TBS-T 洗膜3 次，每次10 min；室溫下孵育相應(yīng)二抗1 h；TBS-T 洗膜3 次，每次10 min；然后使用ECL化學(xué)發(fā)光液在Bio-Rad分子成像儀上成像，并用Image J軟件進行灰度分析。

1.2.4 免疫熒光分析

細胞計數(shù)后鋪于共聚焦小皿中，轉(zhuǎn)染48 h 后；PBS洗膜3次，每次10 min；4%多聚甲醛固定20 min；PBS 洗滌3 次，每次3 min；然后在室溫下用0.5%Tritonx-100 滲透20 min；PBS 洗滌3 次，每次3 min；山羊血清封閉30 min；4 ℃孵育一抗過夜；PBST 洗滌3 次，每次3 min；37 ℃孵育熒光二抗1 h；PBST洗滌3次，每次3 min；DAPI染色5 min；PBST洗滌4次，每次5 min。圖像使用激光共焦顯微鏡拍攝。

1.2.5 細胞周期分布的檢測

細胞轉(zhuǎn)染48 h 后用不含EDTA 的胰酶消化，收集各組細胞后-20 ℃固定于無水乙醇中。檢測當(dāng)天將固定細胞離心棄去乙醇，加入3 mL室溫下的PBS放置15 min 使細胞再次水化，離心棄上清，加入1 mL DNA staining solution 渦旋振蕩5 s 混勻，室溫避光孵育30 min 后使用流式細胞分析儀檢測細胞周期分布。

1.2.6 細胞劃痕實驗

將A375 細胞鋪于6 孔板中，轉(zhuǎn)染48 h，待細胞貼壁生長至80%時，用10 μL 無菌移液槍頭沿孔中間輕輕劃過，然后用PBS 洗滌細胞2 次去除漂浮細胞，分別于0、48 h拍照，觀察劃痕愈合情況。

1.2.7 Transwell實驗

制備細胞懸液前先讓細胞撤血清饑餓6 h，進一步去除血清的影響，消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS 洗1～2 遍，用無血清培養(yǎng)基重懸。取細胞懸液100 μL（1×105個細胞）加入Transwell 小室；24 孔板下室加入500 μL 含30%FBS 的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12 h。吸除小室培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，用濕棉球擦去上表面細胞，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗掉多余染色，用鑷子取下小室底膜，封片觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 5.0 分析從3 個獨立實驗中獲得的數(shù)據(jù)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WNT7b在不同黑素瘤細胞中的表達情況

qRT-PCR 及Western blot 結(jié)果顯示，WNT7b 在人源黑素瘤細胞A375、SK-MEL-28、A875 中均有表達，A375較其他細胞系WNT7b表達量更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 不同黑素瘤細胞系中WNT7b的表達水平Figure 1 Expression levels of WNT7b in melanoma cell lines

2.2 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染A375細胞WNT7b敲低效率檢測

選取WNT7b表達量高的A375細胞系進行siRNA瞬時轉(zhuǎn)染，qRT-PCR 及Western blot 結(jié)果顯示與NC組相比，WNT7b-siRNA 轉(zhuǎn)染組A375 細胞中WNT7b mRNA 及蛋白表達量均明顯降低，敲低效率達60%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖2）。

圖2 A375 細胞中WNT7b 在mRNA 與蛋白水平敲低效率的檢測Figure 2 Knockdown efficiency detection of WNT7b mRNA and protein in A375 cells

2.3 WNT7b敲低對A375細胞生長周期的影響

流式細胞分析檢測細胞周期，結(jié)果顯示，與NC組相比，WNT76-siRNA組G1 期細胞數(shù)量增加，說明敲低WNT7b 后，A375 細胞生長阻滯于G1 期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。

圖3 敲低WNT7b對A375細胞周期的影響Figure 3 Effects of WNT7b knockdown on the cell circle of A375 cells

2.4 WNT7b敲低對A375細胞遷移、侵襲能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示W(wǎng)NT7b敲低后A375細胞遷移能力受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖4A）；Transwell實驗結(jié)果顯示W(wǎng)NT7b敲低后A375細胞侵襲性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖4B）。

圖4 敲低WNT7b對A375細胞遷移和侵襲能力的影響Figure 4 Effects of WNT7b knockdown on migration and invasion ability of A375 cells

2.5 WNT7b 敲低對A375 細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響

考慮到WNT7b敲低后A375細胞遷移和侵襲能力受到抑制，我們進一步評估了WNT7b 敲低后A375細胞的EMT過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT7b-siRNA組表現(xiàn)出上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin 表達上調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin 及Vimentin 的表達下調(diào)，調(diào)控黑素瘤細胞EMT 的關(guān)鍵因子Snail 也被同時下調(diào)（圖5）。在細胞培養(yǎng)方面可觀察到，WNT7b 敲低后A375 細胞由紡綞形的間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成多角形的上皮細胞形態(tài)，免疫熒光分析顯示W(wǎng)NT7b廣泛分布于細胞質(zhì)中，敲低WNT7b 后WNT7b-siRNA 組的細胞呈上皮細胞樣改變（圖6）。以上結(jié)果從EMT分子標(biāo)志物以及細胞形態(tài)學(xué)改變兩方面說明WNT7b參與了A375細胞的EMT過程。

圖5 敲低WNT7b對A375細胞EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白表達的影響Figure 5 Effects of WNT7b knockdown on EMT markers of A375 cell

2.6 WNT7b敲低對A375細胞中MMP的影響

MMP 是介導(dǎo)細胞外基質(zhì)降解的含鋅內(nèi)肽酶。MMP 在腫瘤細胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成過程中發(fā)揮著重要作用，同時也被認(rèn)為是EMT的誘導(dǎo)因子［11-12］。因此我們通過Western blot 對NC 組與WNT7b-siRNA 組中與黑素瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-7及MMP-9表達降低，其中MMP-9降低最顯著（圖6A），進而通過免疫熒光分析對MMP-9的降低進行了驗證（圖6B）。說明WNT7b可能通過MMP影響A375細胞的遷移、侵襲與EMT過程。

圖6 敲低WNT7b對A375細胞MMP家族成員表達的影響Figure 6 Effects of WWT76 knockdown on MMP members of A375 cells

3 討論

惡性黑素瘤進展極快，且對放療及化療不敏感。臨床上早期惡性黑素瘤患者通過手術(shù)切除，其5 年總體生存率達95%以上，但對于中晚期黑素瘤患者來說，目前還沒有有效的治療方法能顯著延長患者生存期［13］。近年來免疫治療與基因靶向治療手段發(fā)展迅速，主要包括免疫檢查點抑制劑療法［14-15］和MAPK/ERK 細胞信號通路抑制劑［16］，但單一治療效果欠佳。研究顯示，聯(lián)合兩種及兩種以上不同作用機制的方法或藥物治療的效果比單一治療有明顯提升［17-19］。因此，在深入探究惡性黑素瘤發(fā)病機制、尋找更有效的治療靶點基礎(chǔ)上，為患者提供精準(zhǔn)的治療方案成為未來發(fā)展的方向。

經(jīng)典WNT信號通路也叫Wnt/β-catenin途徑，通過調(diào)節(jié)LEF/TCF家族DNA轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細胞的行為，其核心是胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定性，β-catenin水平低下時，Wnt 通路關(guān)閉；當(dāng)其水平較高時，Wnt 通路開放。近年研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑素瘤的高侵襲轉(zhuǎn)移傾向與WNT 信號通路的異常激活有關(guān)［6］。在WNT 蛋白家族中，WNT3a 可減少黑素瘤細胞間的黏附，促進其遷移［20］；WNT5a 可激活NF-κB 信號通路，并通過分泌細胞因子和趨化因子對黑素瘤產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用［21］，還能誘導(dǎo)MARCKS蛋白磷酸化促進黑素瘤的轉(zhuǎn)移［22］。然而，作為WNT蛋白家族中另一關(guān)鍵蛋白分子，WNT7b在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的功能未見報道。本研究首先檢測了黑素瘤細胞系中WNT7b的表達情況，發(fā)現(xiàn)WNT7b 在人惡性黑素瘤細胞系A(chǔ)375、SK-MEL-28、A875中均有表達，其中A375細胞系表達量最高，這可能與A375細胞系較SK-MEL-28與A875細胞系，具有更強侵襲性與更短的成瘤時間有關(guān)［23-24］。通過流式細胞周期分析、劃痕實驗、Transwell實驗發(fā)現(xiàn)敲低WNT7b使A375細胞生長阻滯于G1期，同時細胞的遷移與侵襲能力受到抑制。

EMT是黑素瘤發(fā)生發(fā)展過程中的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為細胞由多角形的上皮細胞轉(zhuǎn)變成紡綞形的間質(zhì)細胞，細胞極性喪失，細胞間黏附力下降，同時誘導(dǎo)血管生成，致腫瘤細胞遷移和侵襲能力大大增加［25］。WNT信號通路在黑素瘤EMT誘導(dǎo)中起重要作用［20］，WNT 信號通路激活后可使E-cadherin 表達下調(diào)，Snail表達上調(diào)，E-cadherin的缺失釋放鈣黏蛋白結(jié)合的β-catenin，游離的β-catenin 可以遷移到細胞核并誘導(dǎo)促侵襲因子的轉(zhuǎn)錄［26］。我們通過Western blot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白，發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志物E-cadherin 表達上調(diào)、間充質(zhì)標(biāo)志物包括Ncadherin和Vimentin下調(diào)以及重要調(diào)節(jié)因子Snail下調(diào)，說明WNT7b可能參與A375細胞的EMT過程。

MMP作為EMT的誘導(dǎo)因子，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展、遷移侵襲與轉(zhuǎn)移［27］。其中MMP-2和MMP-9作為明膠酶主要切割Ⅳ型膠原蛋白，在黑素瘤進展中起關(guān)鍵作用。MMP-2的高表達與結(jié)構(gòu)損傷、異型性進展和血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；MMP-9在炎性細胞如巨噬細胞、嗜中性粒細胞和肥大細胞中表達較高，促進黑素瘤的放射狀生長，因此可能與腫瘤侵襲的早期階段有關(guān)。同時MMP-9 可通過增強血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細胞生長因子在惡性腫瘤中的表達，間接通過增加營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)促進腫瘤侵襲發(fā)展［28］。因此我們進一步對MMP家族關(guān)鍵分子進行檢測，發(fā)現(xiàn)WNT7b敲低后，A375細胞中MMP-2、MMP-7與MMP-9表達量降低，其中MMP-9 顯著降低，進而通過免疫熒光分析對MMP-9 的降低再次進行了驗證，認(rèn)為WNT7b 可能通過抑制MMP 表達，誘導(dǎo)A375 細胞EMT的發(fā)生，從而促進細胞的遷移、侵襲。

綜上所述，WNT7b可促進惡性黑素瘤細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲，MMP-9作為WNT7b下游重要蛋白調(diào)控分子，參與惡性黑素瘤細胞EMT 過程，但其中更多的分子間相互作用以及具體調(diào)控途徑有待進一步研究。本研究可為惡性黑素瘤的精準(zhǔn)基因靶向治療提供新參考。