弓玉祥，倪維杰，倪海鋒，張思宇，楊旻宇，陳平圣，*

1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎臟病研究所，江蘇 南京 210009；2東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009

膿毒血癥是一種由病原菌、創(chuàng)傷、外科感染等因素引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammative reaction syndrome，SIRS），其特點(diǎn)是對感染性損傷的全身炎癥反應(yīng)。這一過程往往導(dǎo)致廣泛的組織損傷和多器官功能障礙，而急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是其最常見的并發(fā)癥［1-2］。既往研究表明，內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是引起急性肝損傷的主要因素［3］，LPS 可以顯著上調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），而這些細(xì)胞因子會引起嚴(yán)重的肝組織損傷［4-5］。此外，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為在ALI 的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［6］。肝臟中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性，導(dǎo)致廣泛的肝細(xì)胞破壞［7］。到目前為止，仍舊缺乏治療ALI 的有效手段。因此，闡明ALI 的病理機(jī)制，是亟待解決的問題。

活性維生素D3（vitamin D3，Vit D3）是一種脂溶性維生素，1，25（OH）2D3是其活性形式［8-9］。研究表明，Vit D3的缺乏與膿毒癥的病死率和機(jī)械性通氣的持續(xù)時(shí)間顯著相關(guān)［10-11］。既往研究發(fā)現(xiàn)1，25（OH）2D3的生物學(xué)效應(yīng)主要是由維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）介導(dǎo)，VDR 在許多細(xì)胞中表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等；而Vit D3 通過VDR 調(diào)控細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化等信號通路［12］。大量研究證實(shí)Vit D3對ALI具有治療作用，而其潛在機(jī)制尚不清楚［13-14］。

因此，本研究旨在闡明Vit D3 對LPS 誘導(dǎo)小鼠ALI的保護(hù)機(jī)制，為臨床治療ALI提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

Vit D3（羅蓋全J20150011，羅氏公司，美國），LPS（L2630，Sigma 公司，美國）?？寡t素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（BM4010）、核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2p45-related factor 2，Nrf2）抗體（PB9290）、抗VDR抗體（BA2877-2）、抗TNF-α抗體（A00002-5）（武漢博士德生物公司）；抗NF-κB p65 抗體（8242）、抗IL-1β 抗體（12703）、抗Lamin A/C 抗體（4777）、抗鼠二抗（7076）、抗兔二抗（7074）（Cell Signaling Technology公司，美國）；抗NF-κB p50 抗體（ab131546，Abcam公司，美國）。TNF-α ELISA 試劑盒（EK0525，武漢博士德生物），IL-1β ELISA 試劑盒（ab100705，Abcam 公司，美國）。丙二醛測定試劑盒（malondialdehyde，MDA，A003-1-2）、超氧化物歧化酶測定試劑盒（superoxide dismutase，SOD，A001-3-2）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶試劑盒（glutathione S transferase，GST，A004-1-1）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR，A062-1-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX，A005-1-2）、過氧化氫酶（catalase，CAT，A007-1-1）（南京建成生物工程研究所）。光學(xué)顯微鏡（Olympus BX41）及透射電鏡（TEM，HT7700）（Olympus公司，日本）。

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重20～25 g（合格證號：201716345，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司）。動物飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心動物房，溫度22～24 ℃，濕度為40%～70%，光照明暗各12 h，換氣次數(shù)為10～20 次/h。飼料為鼠滅菌飼料，購自東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，符合GB-15921.2-2014標(biāo)準(zhǔn)。飲水為經(jīng)121 ℃、30 min滅菌自來水，由動物經(jīng)飲水瓶自由攝取。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組

預(yù)先配制LPS 濃度為1.0 mg/mL。將40 只雄性C57BL/6 小鼠按體重隨機(jī)分為對照組、Vit D3 組、模型組（LPS 組）和治療組（LPS+Vit D3 組），每組10 只。小鼠給予15 mg/kg LPS 腹腔注射建立膿毒血癥小鼠ALI模型。造模即刻、造模后8 h、16 h，Vit D3組和LPS+Vit D3組再給予2.5 μg/kg Vit D3灌胃，對照組和LPS組則給予等體積生理鹽水灌胃［15］。

1.2.2 標(biāo)本收集

造模后24 h 處死小鼠。小鼠采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉。仰位固定，用一次性注射器（2 mL）心尖取血，室溫下3 000 r/min 離心10 min 后取上清液送醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測肝腎功能，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine，Scr）水平。開腹取肝，約2/3 肝固定于4%甲醛溶液中做肝臟病理光鏡及免疫組化檢查，1/3 肝組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，另取小塊肝組織置于2.5%戊二醛溶液中固定，備電鏡檢查。

1.2.3 肝臟病理檢查

4%甲醛固定的部分肝組織，經(jīng)清洗、梯度酒精脫水、浸蠟、包埋等步驟后，制成石蠟塊；再用切片機(jī)切出厚度為4 μm切片，攤片、烤片，后按常規(guī)操作行HE染色。光鏡下觀察肝組織損傷程度和炎癥反應(yīng)。

1.2.4 肝臟電鏡檢查

小鼠肝臟分離，用生理鹽水清洗，切成小塊（1 mm3），立即固定在含2.5%戊二醛溶液中，后固定在1%鋨酸溶液中。然后，在梯度酒精中連續(xù)脫水。用丙酮代替乙醇后，將組織嵌入環(huán)氧樹脂中并切成超薄切片。切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，電鏡觀察。

1.2.5 MDA 水平及SOD、GST、GR、GPX、CAT 活性檢測。

將肝組織于冷生理鹽水中勻漿，按照廠家提供的實(shí)驗(yàn)步驟采用比色法測定MDA 水平和SOD、GST、GR、GPX、CAT活性。

1.2.6 ELISA法檢測小鼠血清TNF-α、IL-1β含量

按照廠家提供的步驟采用ELISA 法測定血清TNF-α、IL-1β水平。

1.2.7 免疫組化檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

將肝組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟和復(fù)水處理后，用微波法進(jìn)行抗原修復(fù)。以3%過氧化氫甲醇溶液處理切片滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，以10%胎牛血清封阻30 min；分別加入各種一抗，TNF-α抗體（1∶100）及IL-1β抗體（1∶100），孵育過夜；PBS 沖洗3 次，每次3 min，后加入二抗，孵育15 min；PBS沖洗3 次，每次3 min，加入DAB 顯色；PBS 沖洗后，以蘇木素復(fù)染，自然風(fēng)干后封片觀察。

1.2.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

取適量的肝組織，冰上勻漿，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，Bradford 法測定蛋白濃度。每孔上樣100 μg蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育，4 ℃過夜，次日室溫孵育HRP 標(biāo)記的二抗1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光，顯影定影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，Bio-Rad Quantity one version 4.6.7 軟件對相應(yīng)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測VDR mRNA的水平

取適量的肝組織加入TRIzol 勻漿提取總mRNA，核酸分析儀檢測樣本中mRNA 的質(zhì)量；對檢測合格的樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；按實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒說明書依次添加試劑后進(jìn)行擴(kuò)增，條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，61 ℃31 s，循環(huán)40 次；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。使用2-ΔΔCt法分析所得數(shù)據(jù)。小鼠VDR引物序列，上游5′-CACAAGACCTACGACC-CCAC-3′，下游5′-CATCATGTCCAGTGAGGGGG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，多個樣本之間的兩兩比較采用Dunnett’st檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vit D3顯著改善肝臟損傷

Vit D3 處理顯著改善小鼠的生存率（圖1A）。與對照組相比，LPS 組血清ALT 和AST 的水平顯著增加（P＜0.01，圖1B、C）。而Vit D3處理后，這一改變得到逆轉(zhuǎn)。HE 染色被用來評估肝損傷程度。對照組和Vit D3 組肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，而LPS 組的肝組織結(jié)構(gòu)混亂，炎細(xì)胞浸潤顯著增多，而這些變化被Vit D3所抑制（圖1D）。Vit D3處理后小鼠的腎功能也得到保護(hù)（表1）。

表1 各組小鼠體重及腎功能Table 1 The body weight and kidney function in each group

圖1 Vit D3對LPS誘導(dǎo)急性肝損傷血清轉(zhuǎn)氨酶水平及組織病理學(xué)改變的影響Figure 1 The effect of Vit D3 on serum transaminase level and histopathological changes in LPS-induced acute liver injury

2.2 Vit D3通過Nrf2/HO-1通路改善肝細(xì)胞氧化損傷

鏡下可以觀察到對照組、Vit D3 組肝細(xì)胞中正常的線粒體形態(tài)，而LPS組線粒體腫脹明顯，甚至可以觀察到線粒體空泡變性，線粒體嵴消失，Vit D3治療顯著抑制了這些變化（圖2A）。進(jìn)一步對MDA和抗氧化酶活性的檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組和Vit D3 組相比，LPS組MDA水平顯著增加（P＜0.01），SOD、GST、GR、GPX和CAT的活性顯著下降（P＜0.01），而這一LPS 誘導(dǎo)的氧化損傷被Vit D3 所逆轉(zhuǎn)（P＜0.01，圖2B～G）。Nrf2/HO-1 通路在氧化損傷中起到重要作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與LPS 組相比，LPS+Vit D3 組Nrf2和HO-1的表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖2H～J）。

圖2 Vit D3對LPS誘導(dǎo)急性肝損傷線粒體損傷和氧化應(yīng)激的影響Figure 2 Effects of Vit D3 on mitochondrial injury and oxidative stress induced by LPS in acute liver injury

2.3 Vit D3處理減少炎癥損傷

炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β在LPS 誘導(dǎo)的ALI起到關(guān)鍵作用。與LPS組相比，血清TNF-α和IL-1β的水平在Vit D3 處理后顯著下調(diào)（P＜0.01，圖3A、B），而肝組織中TNF-α和IL-1β的蛋白水平與血清中一致（圖3C～F）。結(jié)果顯示，在LPS處理后，肝組織中NF-κB p65和p50顯著升高（P＜0.01），而Vit D3處理逆轉(zhuǎn)了這一改變（P＜0.01，圖3G～I(xiàn)）。

圖3 Vit D3對LPS誘導(dǎo)急性肝損傷炎癥反應(yīng)的影響Figure 3 Effects of Vit D3 on LPS-induced acute liver injury

2.4 Vit D3治療對肝臟核VDR水平的影響

如前文所述，Vit D3 主要通過VDR 發(fā)揮作用，因此進(jìn)一步探究了VDR 的表達(dá)水平。與對照組相比，LPS 組VDR 表達(dá)顯著減少（P＜0.01），Vit D3 處理后，VDR表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01，圖4）。

圖4 各組小鼠肝組織中VDR表達(dá)比較Figure 4 Comparison of VDR expression in liver tissues of mice in each group

3 討論

ALI是一種病死率高、危及生命的臨床綜合征［1］。Vit D3 具有多種藥理作用，例如抗氧化、抗炎等［16］。本研究揭示了Vit D3對LPS誘導(dǎo)的ALI具有保護(hù)作用，Vit D3處理可以顯著改善LPS誘導(dǎo)的肝損傷，減少氧化應(yīng)激，降低炎癥水平。這些發(fā)現(xiàn)表明Vit D3是一種有吸引力的治療ALI的藥物。

LPS 是革蘭陰性細(xì)菌所分泌內(nèi)毒素的主要成分，可通過刺激包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，從而使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡與壞死，LPS誘導(dǎo)的ALI 動物模型被廣泛使用，用于探討和評價(jià)肝保護(hù)劑的療效［17-18］。本研究中LPS注射導(dǎo)致小鼠血清ALT和AST水平升高，肝臟發(fā)生病理改變，提示LPS引起了肝臟損傷。與此同時(shí)，Vit D3 處理顯著降低了血清AST 和ALT 水平，緩解了系統(tǒng)炎癥水平，抑制了肝臟氧化損傷和炎癥。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，Vit D3處理后，Scr和BUN水平顯著下降，這與之前的研究一致，說明了Vit D3 對LPS 誘導(dǎo)的急性腎損傷具有顯著的保護(hù)作用［15］。這些結(jié)果表明，Vit D3 的保護(hù)機(jī)制可能并非是器官特異性的，而是涉及不同器官間廣泛存在的抗損傷通路。

肝損傷的發(fā)生與炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān)，既往研究表明，LPS誘導(dǎo)的肝損傷涉及炎癥反應(yīng)［19］。LPS 激活炎癥細(xì)胞，如Kupffer 細(xì)胞等，釋放過量的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α 和IL-1β，而這些促炎細(xì)胞因子的釋放是觸發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟［20-21］。因此，本研究測定了血清和肝臟組織中TNF-α 和IL-1β 的水平，結(jié)果顯示Vit D3 明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 和IL-1β上調(diào)。

NF-κB廣泛參與了炎癥反應(yīng)，一旦被LPS激活，IκB 磷酸化和降解，釋放NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)，NF-κB 通路在LPS 誘導(dǎo)ALI 中起到重要作用［15］。因此，我們研究了Vit D3 對NF-κB 激活的影響。結(jié)果表明，服用Vit D3顯著抑制了NF-κB p65和p50蛋白的表達(dá)，從而提示Vit D3 對ALI 的炎癥抑制可能是通過抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。

氧化應(yīng)激引起的ROS 產(chǎn)生和線粒體功能障礙是LPS 誘導(dǎo)ALI 的另一可能機(jī)制［22］。氧化應(yīng)激被認(rèn)為在ALI 的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的病理生理作用［23］。既往研究證實(shí)，Nrf2 在誘導(dǎo)抗氧化酶如SOD、GST、GR、GPX、CAT對抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，同樣的，HO-1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子Nrf2控制，近期研究表明Nrf2信號通路在LPS誘導(dǎo)的ALI中發(fā)揮保護(hù)作用［24-25］。本研究結(jié)果顯示，Vit D3增加了Nrf2和HO-1 的表達(dá)，降低了肝組織MDA 水平，提高了SOD、GST、GR、CAT和GPX等酶的活性，減輕了LPS誘導(dǎo)的肝臟線粒體損傷。

本研究結(jié)果揭示了，在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中，Vit D3具有抗氧化和抗炎作用，然而其潛在機(jī)制尚不清楚。眾所周知，Vit D3的效用主要由VDR介導(dǎo)［10］，而研究表明，VDR在炎癥和氧化應(yīng)激調(diào)控中發(fā)揮重要作用。據(jù)此我們推測，在LPS誘導(dǎo)的ALI中，Vit D3的保護(hù)作用主要是由VDR 介導(dǎo)的。本研究結(jié)果提示，與對照組相比，LPS 組肝組織中VDR 的蛋白表達(dá)顯著下降，Vit D3處理后，VDR表達(dá)明顯上調(diào)。因此，本研究初步證實(shí)了使用Vit D3 是治療ALI 行之有效的辦法，并且從炎癥和氧化應(yīng)激兩個方面初步解析了其作用機(jī)制。

綜上所述，Vit D3 能顯著抑制血清中ALT 和AST 的水平，并能顯著抑制組織病理學(xué)改變，此外，Vit D3 可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥，而這一效果可能由VDR 通路介導(dǎo)。這些結(jié)果都表明，Vit D3可能成為治療急性膿毒血癥肝損傷的候選藥物。