陳 穎，康剛勁，王妍茜，徐曼華，楊 濤

?KEYWORDS:cataract; human lens epithelial cells; pyroptosis; estrogen

0引言

白內(nèi)障是目前全世界致盲的最常見疾病[1]，其中年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病率最高。既往多數(shù)學(xué)者認(rèn)為白內(nèi)障的產(chǎn)生是由于晶狀體上皮細(xì)胞在各種致病因素刺激下, 發(fā)生過度凋亡, 導(dǎo)致晶狀體發(fā)生一系列病理改變，并表明晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是除了先天性白內(nèi)障以外其他類型白內(nèi)障的病理學(xué)基礎(chǔ)[2]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中還存在著一種不同于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞程序性死亡——細(xì)胞焦亡[3]。當(dāng)晶狀體上皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激下，可產(chǎn)生大量活性氧，促使細(xì)胞焦亡，誘發(fā)白內(nèi)障。

細(xì)胞焦亡是一種伴隨炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡[4]。其途徑分為兩型，即經(jīng)典型與非經(jīng)典型。經(jīng)典型焦亡途徑是通過細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體接收刺激信號(hào)后，借助凋亡相關(guān)微粒蛋白(CARD-domain containing adaptor protein,ASC)與半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，pro-caspase-1)結(jié)合，形成炎性復(fù)合體，促發(fā)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。模式識(shí)別受體包括NLRs受體(NOD-like receptors)、Toll樣受體(Toll-like receptors)和PYHIN蛋白。而目前研究較多也較成熟的通路為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)參與及依賴半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)介導(dǎo)的經(jīng)典型焦亡途徑。當(dāng)NLRP3接收外界刺激信號(hào)后，借ASC與pro-caspase-1結(jié)合，形成NLRP3炎癥小體[5]。激活自身蛋白酶后，生成有催化活性的Caspase-1。Caspase-1切割GSDMD(gasderminD)，釋放N-端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-N)。GSDMD-N遷移在質(zhì)膜上形成非特異性孔洞，從而促進(jìn)細(xì)胞滲透裂解。Caspase-1活化后可以刺激白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的釋放，從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[6]。

雌激素被認(rèn)為具有保護(hù)人晶狀體上皮細(xì)胞的作用[7-8]，其機(jī)制與抗凋亡、抗氧化等相關(guān)。而此保護(hù)機(jī)制是否與抗焦亡相關(guān)，目前仍無有關(guān)的研究。故本文旨在探究雌激素對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制與細(xì)胞焦亡的相關(guān)性，為局部及全身用藥預(yù)防年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展提供新的研究思路。

1材料和方法

1.1材料人晶狀體上皮細(xì)胞HLE-B3細(xì)胞系(ATCC，美國(guó))，17-β雌二醇(17β-estradiol，E2)粉末，H2O2試劑(Sigma，美國(guó))，噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)粉，BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)，TUNEL試劑盒(Roche，英國(guó))，CCK-8檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司)，Caspase-1抗體(Novus，美國(guó))，GSDMD抗體(Thermo，美國(guó))，NLRP3抗體(武漢三鷹，中國(guó))、GAPDH抗體(Abcam，英國(guó))，IL-1β檢測(cè)試劑盒(云克隆，中國(guó))，超凈工作臺(tái)(Thermo，美國(guó))，恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))，共聚焦顯微鏡(Leica，德國(guó))，電泳儀(BIORAD，美國(guó))，紫外分光光度計(jì)(HACH，美國(guó))，膠片分析儀(天能公司，中國(guó))，掃描電子顯微鏡(Tescan，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將HLE-B3細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫孵箱培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，按1∶3比例傳代，每3d傳代一次。待細(xì)胞經(jīng)4次傳代生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法確定H2O2處理濃度及時(shí)間將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化混勻后，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度為每毫升10×104個(gè)，按每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中。次日棄去96孔板中培養(yǎng)基，加入含0、50、100、200μmol/L H2O2培養(yǎng)基，分別處理6、12、24h。棄去孔板中的培養(yǎng)基后，加入200μL培養(yǎng)基、20μL濃度為5mg/L MTT溶液。恒溫箱中作用4h后棄去培養(yǎng)基及MTT溶液，加入150mL DMSO洗去多余結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測(cè)光吸收值。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)MTT法確定H2O2處理濃度為100μmol/L，時(shí)間為12h。隨機(jī)將細(xì)胞依據(jù)參考文獻(xiàn)[22,25]分為五組?？瞻讓?duì)照組:含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)HLE-B3細(xì)胞；H2O2處理組：培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，加入含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基處理12h；雌二醇1組(1×10-3μmol/L雌二醇+H2O2處理組)；雌二醇2組(1×10-2μmol/L雌二醇+H2O2處理組)；雌二醇3組(1×10-1μmol/L雌二醇+H2O2處理組)。

1.2.4免疫熒光染色檢測(cè)GSDMD蛋白的分布及熒光強(qiáng)度將處理后的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，細(xì)胞懸液滴加至蓋玻片上培養(yǎng)約6h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30min，加入GSDMD一抗于4℃孵育過夜。洗滌后予以二抗室溫孵育50min。滴加DAPI染液，室溫孵育5min后洗滌3次。滴加適量的抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活力取出細(xì)胞，胰蛋白酶消化，配制成濃度為每毫升1×105個(gè)的細(xì)胞懸液，按10 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加100μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理。每個(gè)濃度的樣本設(shè)五個(gè)復(fù)孔。所有孔中加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2h。酶標(biāo)儀測(cè)定450nm光密度值(optical density，OD)。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.6TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞焦亡待細(xì)胞爬片后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30min，按TUNEL試劑盒說明書操作，DAPI染液染色，室溫避光孵育5min，洗滌3次。滴有抗熒光淬滅劑的蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7Western-blot法檢測(cè)GSDMD和NLRP3及Caspase-1蛋白濃度用PBS緩沖液潤(rùn)洗貼壁細(xì)胞3次，加入細(xì)胞總蛋白提取試劑使細(xì)胞完全裂解。收集上清液，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。確定每個(gè)樣品總蛋白上樣量均為40μg。電泳、轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1h，一抗稀釋液4℃孵育過夜。洗滌干凈后，二抗稀釋液室溫孵育30min。PBS洗滌后曝光、顯影。由Alpha Ease FC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.2.8ELISA法檢測(cè)IL-1β含量將細(xì)胞懸液，按1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加100μL。待貼壁后根據(jù)分組加入含不同濃度雌二醇培養(yǎng)基，空白對(duì)照組更換為含胎牛血清的培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)24h后。H2O2處理組及各雌二醇組加入含100μmol/L H2O2培養(yǎng)基處理12h。每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔。經(jīng)冰凍溶解、低溫離心后收集上清液。包被、封閉、顯色后，加入終止液，最后分光光度計(jì)各孔OD值，設(shè)置波長(zhǎng)為450nm。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2結(jié)果

2.1掃描電子顯微鏡下觀察各組HLE-B3細(xì)胞形態(tài)變化情況在掃描電子顯微鏡下觀察到空白對(duì)照組與雌二醇3組中細(xì)胞形態(tài)呈圓形，邊界清楚(圖1)。而在H2O2處理組、雌二醇1組、雌二醇2組中可見明顯細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。在H2O2處理組、雌二醇1組中出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)稍腫脹、“囊泡”及“孔隙”形成。而在雌二醇2組中細(xì)胞腫脹不明顯，但仍有“囊泡”及“孔隙”形成。

2.2免疫熒光染色檢測(cè)雌二醇對(duì)GSDMD免疫熒光的影響共聚焦顯微鏡下觀察雌二醇對(duì)HLE-B3細(xì)胞中GSDMD免疫熒光的影響。當(dāng)特異性抗體與細(xì)胞膜上的GSDMD相結(jié)合后，在共聚焦顯微鏡下可觀察到紅色熒光(圖2)。各組熒光強(qiáng)度情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.656，P<0.001，表1)。H2O2處理組中熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H2O2處理組相比較，各雌二醇組中免疫熒光強(qiáng)度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在一定濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨雌二醇濃度遞增而呈減弱趨勢(shì)。

圖2 免疫熒光染色檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞熒光強(qiáng)度 A:空白對(duì)照組;B:H2O2處理組;C:雌二醇1組;D:雌二醇2組;E:雌二醇3組。

2.3CCK-8法檢測(cè)雌二醇對(duì)HLE-B3細(xì)胞活力的影響各組細(xì)胞存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=81.275，P<0.001，表1)。H2O2處理組細(xì)胞活力較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2處理組相比，各雌二醇組細(xì)胞活力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率隨雌二醇濃度遞增而呈遞增趨勢(shì)。

2.4雌二醇對(duì)細(xì)胞焦亡率的影響TUNEL法經(jīng)檢測(cè)細(xì)胞發(fā)生DNA的斷裂情況從而檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞的焦亡情況(圖3)。各組細(xì)胞焦亡情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=455.585，P<0.001，表1)。H2O2處理組細(xì)胞焦亡率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H2O2處理組相比較，各雌二醇組中細(xì)胞焦亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞焦亡率隨雌二醇濃度遞增而呈遞減趨勢(shì)。

圖3 TUNEL法檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞焦亡情況 A:空白對(duì)照組;B:H2O2處理組;C:雌二醇1組;D:雌二醇2組;E:雌二醇3組。

2.5Western-blot法檢測(cè)NLRP3和GSDMD和Caspase-1蛋白表達(dá)情況

2.5.1Western-blot法檢測(cè)雌二醇對(duì)NLRP3蛋白表達(dá)的影響各組NLRP3蛋白表達(dá)(灰度比)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.866，P<0.001，表1)。H2O2處理組NLRP3蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2處理相比，各雌二醇組中NLRP3蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在雌二醇組中NLRP3蛋白表達(dá)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，NLRP3蛋白隨雌二醇濃度遞增而呈遞減趨勢(shì)，見圖4。

2.5.2Western-blot法檢測(cè)雌二醇對(duì)GSDMD蛋白表達(dá)的影響各組GSDMD蛋白表達(dá)(灰度比)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=63.886，P<0.001，表1)。H2O2處理組GSDMD蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2處理相比，各雌二醇組中GSDMD蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在雌二醇組中GSDMD蛋白兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，GSDMD蛋白隨雌二醇濃度遞增而呈遞減趨勢(shì)，見圖5。

2.5.3Western-blot法檢測(cè)雌二醇對(duì)Caspase-1蛋白表達(dá)的影響各組Caspase-1蛋白表達(dá)(灰度比)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.918，P=0.001，表1)。H2O2處理組Caspase-1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2處理相比，各雌二醇組中Caspase-1蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雌二醇各組中Caspase-1蛋白兩兩比較，雌二醇2組與雌二醇3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.35)，雌二醇1組與雌二醇2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.27)，而雌二醇1組與雌二醇3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)，見圖6。

圖6 Western-blot法檢測(cè)雌二醇對(duì)Caspase-1蛋白表達(dá)的影響 A:空白對(duì)照組;B:H2O2處理組;C:雌二醇1組;D:雌二醇2組;E:雌二醇3組。

2.6ELISA法檢測(cè)雌二醇對(duì)IL-1β分泌量的影響各組IL-1β分泌量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=100.632，P<0.001，表1)。H2O2處理組IL-1β分泌量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H2O2處理組相比較，各雌二醇組中IL-1β分泌量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，隨著雌二醇濃度遞增，而IL-1β濃度呈遞減趨勢(shì)。

表1 各組相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3討論

隨著我國(guó)人口的老齡化，年齡相關(guān)性白內(nèi)障已成為嚴(yán)重影響人民生活水平的疾病之一。然而，目前白內(nèi)障尚無有效的預(yù)防措施，其主要且有效的治療方式仍然是手術(shù)。手術(shù)治療所需的費(fèi)用、耗材，以及患者需承擔(dān)的痛苦及手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)等都成為需要被重視和解決的問題。因此，明確年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步探求防治方法已成為一項(xiàng)刻不容緩的工作。

在1992年，Zychlinsky等[9]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞經(jīng)福氏志賀氏桿菌誘導(dǎo)可發(fā)生一種異于凋亡和壞死的細(xì)胞程序性死亡。直到2001年正式將這種由Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式命名為“Pyroptosis”，即：細(xì)胞焦亡[10]。目前已在多種疾病中被發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞焦亡，比如細(xì)菌病毒感染、非酒精性脂肪性肝炎、腫瘤、慢性阻塞性肺疾病等。Jin等[3]研究發(fā)現(xiàn)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生中也存在細(xì)胞焦亡。

細(xì)胞焦亡及凋亡均屬于細(xì)胞程序性死亡。曾經(jīng)有研究以玻璃體腔內(nèi)注射淀粉樣β蛋白(Aβ)后的大鼠為模型，發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可同時(shí)發(fā)生凋亡和焦亡[11]。兩者的相同之處在于：均可發(fā)生DNA斷裂、細(xì)胞核皺縮、形成“囊泡”[12]。不同之處在于，凋亡不發(fā)生質(zhì)膜的破裂，而在焦亡過程中，由于GSDMD-N形成的非特異性孔洞，可導(dǎo)致細(xì)胞滲透裂解[13]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)H2O2處理的人晶狀體上皮細(xì)胞，在掃描電子顯微鏡觀察可見細(xì)胞形態(tài)稍腫脹以及“囊泡”“空隙”形成，并且細(xì)胞活力下降、焦亡率升高。而經(jīng)一定濃度雌二醇誘導(dǎo)后，細(xì)胞腫脹程度及“囊泡”“空隙”形成較改善，細(xì)胞活力升高、焦亡率下降，并隨雌二醇濃度改變而改變。說明一定濃度的雌二醇對(duì)維持晶狀體上皮細(xì)胞的正常形態(tài)及活力有一定作用并且具有濃度依賴性。

細(xì)胞焦亡的途徑分為由Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典途徑以及由Caspase-4、5、11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑[14]。細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑通過形成炎性小體，生成有催化活性的Caspase-1，Caspase-1可切割GSDMD，促發(fā)焦亡的發(fā)生，同時(shí)可促發(fā)炎癥因子的釋放從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。Caspase-1是一種炎性Caspase，且Duprez等[15]認(rèn)為Caspase-1不參與細(xì)胞凋亡。Sun等[16]研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中Caspase-1前體及Caspase-1蛋白表達(dá)高于正常對(duì)照組。本研究亦發(fā)現(xiàn)H2O2可促使HLE-B3細(xì)胞中Caspase-1蛋白及IL-1β表達(dá)上調(diào)，并且一定濃度雌二醇可下調(diào)Caspase-1蛋白的表達(dá)及IL-1β的分泌，并且在此濃度范圍內(nèi)，Caspase-1蛋白表達(dá)及IL-1β分泌可隨雌二醇濃度的遞增而遞減。

NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)家族的一員，與ASC及Caspase-1前體組裝后所得的復(fù)合體被稱為NLRP3炎性小體，可促發(fā)Caspase-1的激活。Zou等[17]認(rèn)為抑制NLRP3可明顯減輕H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。本研究發(fā)現(xiàn)HLE-B3經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后，可促進(jìn)NLRP3蛋白表達(dá)上調(diào)；而雌二醇在一定濃度范圍內(nèi)可下調(diào)NLRP3蛋白的表達(dá)，且在該范圍內(nèi)，其表達(dá)可隨雌二醇濃度的升高而降低。

Gasdermin蛋白家族由GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME(DFNA5)和DFNB59組成[18]，而GSDMD在NLRP3炎癥小體引發(fā)的細(xì)胞焦亡途徑起著重要的作用[19]。Wang等[20]以短波長(zhǎng)藍(lán)光照射大鼠，經(jīng)12wk后，所有實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁，并且發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組上調(diào)，認(rèn)為細(xì)胞焦亡在白內(nèi)障的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。本研究經(jīng)熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GSDMD位于人晶狀體上皮細(xì)胞膜上，H2O2可上調(diào)GSDMD蛋白的表達(dá)，而雌二醇在一定濃度范圍內(nèi)可抑制GSDMD蛋白的表達(dá)，并且此抑制作用隨雌二醇濃度的增加而增強(qiáng)。

已有大量的流行病學(xué)研究及臨床試驗(yàn)證實(shí)雌激素對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[7-8，21-22]。有研究表明雌激素對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞保護(hù)作用主要是通過非基因組機(jī)制，與受體無關(guān)[23]。本研究組也曾發(fā)現(xiàn)雌二醇可通過上調(diào)端粒酶活性而抗人晶狀體細(xì)胞凋亡，且可通過激活SIRT1/P53通路抗凋亡發(fā)揮對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用[24]。但目前尚無研究證實(shí)雌激素對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用是否與抗焦亡相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2可誘導(dǎo)人晶狀體細(xì)胞的焦亡，而這種作用可被雌激素所抑制。并且這種抑制作用在一定范圍內(nèi)隨雌激素濃度的遞增而遞增。由此我們認(rèn)為在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生中可能同時(shí)存在細(xì)胞凋亡及細(xì)胞焦亡的相互作用，并且雌激素對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用不僅可通過抗氧化、抗凋亡等途徑，可能還有抗焦亡過程的參與。

綜上所述，本研究證明了17β-雌二醇對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用具有濃度依賴性，且其保護(hù)機(jī)制與抑制晶狀體上皮細(xì)胞焦亡過程相關(guān)，并有經(jīng)典焦亡途徑參與。為雌激素對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制提供新的研究方向，但雌激素的作用靶點(diǎn)及焦亡過程通路還需進(jìn)一步探索。