肖 曉，符漢麟，陳蓓蓓，莫玉劍，吳育廉

（廣東海洋大學(xué)：1.化學(xué)與環(huán)境學(xué)院/ 2.濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

對蝦養(yǎng)殖業(yè)作為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的代表產(chǎn)業(yè)之一，也是我國出口水產(chǎn)品的第一產(chǎn)業(yè)。為便于保鮮運(yùn)輸，對蝦多以無殼蝦仁供應(yīng)全球市場，從而產(chǎn)生大量蝦殼廢棄物[1-2]。對蝦蝦殼中含有多種活性成分，目前其利用方式主要包括兩種，一是直接粉碎作為動(dòng)物飼料添加劑、魚餌、肥料等[3]；二是通過精加工獲得一些高附加值產(chǎn)品，如甲殼素、殼聚糖等，被廣泛用于食品、醫(yī)學(xué)、保健品等領(lǐng)域[4-6]。目前工業(yè)上多用酸堿法交替法處理蝦殼制備甲殼素、殼聚糖，使得大量的鈣質(zhì)以廢水形式排放，對生態(tài)環(huán)境和民生健康造成嚴(yán)重威脅，同時(shí)也產(chǎn)生巨大的資源浪費(fèi)[7-8]。鈣作為動(dòng)物體內(nèi)必需礦物元素之一，對動(dòng)物生長發(fā)育具有重要的生理作用，而蝦殼含有約20%的活性鈣，可以作為優(yōu)良的前驅(qū)體來制備鈣營養(yǎng)補(bǔ)充劑[7]。因此，有效利用蝦殼中的鈣質(zhì)成為蝦殼資源化利用的關(guān)鍵。

葡萄糖酸鈣具有高溶解性、良好生物相容性和安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，是國際公認(rèn)的一種優(yōu)質(zhì)鈣源[9]，在醫(yī)藥、食品等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用,如作為鈣營養(yǎng)劑添加在飲料、谷類產(chǎn)品中[10]。同時(shí),葡萄糖酸鈣還是一種臨床常用藥物，多用于治療骨質(zhì)疏松、皮膚過敏等病癥[11]。目前，葡萄糖酸鈣制備方法包括電解法、溴化法和發(fā)酵法、金屬催化合成法、酶法等[12-13]，其中工業(yè)生產(chǎn)主要以黑曲霉發(fā)酵法為主。另外，也有研究者以雞蛋殼或貝殼作為鈣源來制備葡萄糖酸鈣[6]。黑曲霉發(fā)酵法工藝比較復(fù)雜、操作條件相對苛刻；利用雞蛋殼或被貝殼制備葡萄糖酸鈣則需要進(jìn)行高溫煅燒，一定程度上造成能源浪費(fèi)。目前尚未見采用葡萄糖酸與蝦殼反應(yīng)一步法制備葡萄糖酸鈣的研究報(bào)道。因此，開展蝦殼的葡萄糖酸脫鈣工藝研究可為葡萄糖酸鈣的制備提供新思路和一定的理論借鑒，同時(shí)也對提高蝦殼的資源化利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蝦殼取自廣東泰聯(lián)海洋食品有限公司對蝦加工生產(chǎn)車間，用水沖洗干凈，70 ℃烘干破碎，后過孔徑0.150 mm 篩，混勻備用。葡萄糖酸、鹽酸、氨水、氯化銨、鈣指示劑、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、碳酸鈣等均為分析純。AUY220 型電子分析天平，日本島津；PHSJ-3F 雷磁酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHZ-D(III)鼓風(fēng)干燥箱，鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司；SHA-B 水浴恒溫振蕩器，杭州旌斐儀器科技有限公司；Thermo Scientific Nicolet iS5 傅立葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；vario MACRO cube元素分析儀，德國元素分析系統(tǒng)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蝦殼脫鈣實(shí)驗(yàn) 取一定量的蝦殼粉置于錐形瓶中，按照一定料液比加入葡萄糖酸溶液，并將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)，在預(yù)定溫度條件下處理一段時(shí)間，過濾，洗滌濾渣，取濾液測定鈣離子含量，計(jì)算脫鈣率。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以脫鈣率為評價(jià)指標(biāo)，分別研究葡萄糖酸濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比對蝦殼脫鈣效果的影響，具體條件如下。

葡萄糖酸濃度：控制反應(yīng)溫度為30 ℃，料液比1∶20 (g/mL)，反應(yīng)時(shí)間2.0 h，葡萄糖酸的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mol/L；

反應(yīng)溫度：濃度為0.4 mol/L，料液比1∶20(g/mL)，反應(yīng)時(shí)間2.0 h，反應(yīng)溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃；

反應(yīng)時(shí)間：控制葡萄糖酸濃度為0.4 mol/L，料液比1∶20 (g/mL)，反應(yīng)溫度為30 ℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 h；

料液比：控制葡萄糖酸濃度為0.4 mol/L，反應(yīng)溫度為30 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2.0 h，料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 和1∶25 (g/mL)。

1.2.3均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取A1（料液比）、A2（反應(yīng)溫度）、A3（反應(yīng)時(shí)間）、A4（酸濃度）為實(shí)驗(yàn)因子，以脫鈣率為指標(biāo)，采取擬水平均勻設(shè)計(jì)U10*(54)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用DPS 7.05 軟件進(jìn)行分析處理，得到對應(yīng)的線性回歸方程，預(yù)測最佳反應(yīng)條件，并對得到最佳反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.4脫鈣率的測定

1.2.4.1蝦殼總鈣含量的測定 參考《GB5009.92-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測定》檢測樣品中的鈣含量[16]，具體操作：將一定量預(yù)處理的蝦殼粉加入到1.0 mol/L 的鹽酸溶液中，控制料液比為1∶20，在室溫條件下反應(yīng)24 h 后，過濾、洗滌濾渣，將濾液轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶定容，取一定體積樣液EDTA-2Na 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 mol/L）進(jìn)行滴定，樣品的總鈣含量按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

其中P為樣品中的總鈣質(zhì)量（單位：g）;c為EDTA-2Na 摩爾濃度（單位：mol/L）；V1為滴定樣液所消耗的EDTA-2Na 的體積（單位：mL）；V0為滴定空白樣品所消耗的EDTA-2Na 的體積（單位：mL）；V2為樣液總體積（單位：mL）；V3為滴定所用樣液體積（單位：mL）；M為EDTA-2Na 的摩爾質(zhì)量（單位：g/mol）。

1.2.4.2鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 參考李文風(fēng)等[17]測試方法：1）稱取經(jīng)干燥預(yù)處理的2.000 g 碳酸鈣置于150 mL 燒杯中，緩慢加入3 mol/L 的鹽酸溶液進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)入250 mL 容量瓶定容；2）準(zhǔn)確吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 溶液至250 mL 錐形瓶中，用去離子水定容至100 mL，加入10 mL 氨水緩沖液，調(diào)節(jié)pH 約等于10，后加入少量鉻黑T 指示劑，搖勻后用EDTA-2Na 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 mol/L）滴定至溶液變藍(lán)色，記錄消耗的EDTA-2Na體積；3）以消耗的EDTA-2Na 體積為橫坐標(biāo)，鈣離子濃度為縱坐標(biāo)繪制鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程。

1.2.4.3脫鈣率的計(jì)算 稱取與1.2.4.1 中相同質(zhì)量的蝦殼粉，用葡萄糖酸進(jìn)行處理，取一定體積脫鈣液按照1.2.4.2 的滴定操作得到消耗的EDTA-2Na體積，根據(jù)鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鈣離子濃度，后按公式（2）計(jì)算脫鈣率：

其中，N為脫鈣率（單位：%）；ρ為鈣離子質(zhì)量濃度（單位：g/L）；V為脫鈣液總體積（單位：mL）；P為樣品的總鈣質(zhì)量（單位：g）。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，根據(jù)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以上所有指標(biāo)以均值或均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦殼的總鈣量

經(jīng)測定，蝦殼的總鈣含量比例約為20.0%，略高于文獻(xiàn)報(bào)道的鈣含量（18.58%）[18]。這可能是由于來源或者生長周期不同的對蝦其蝦殼中鈣含量存在一定的差異。

2.2 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 為鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，其對應(yīng)線性回歸方程為：?=0.003 6x+0.000 3，其中y為鈣離子質(zhì)量濃度（單位：g/L）；x為消耗的EDTA-2Na 體積（單位：mL）。線性相關(guān)數(shù)R2=0.999 8，表明消耗的EDTA-2Na 體積與脫鈣液中的鈣離子濃度存在良好的線性關(guān)系。

圖1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calcium ion standard curve

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)的蝦殼脫鈣效果

2.3.1葡萄糖酸濃度對蝦殼脫鈣效果的影響 由圖2 可知，脫鈣率隨著葡萄糖酸濃度的增加迅速上升，當(dāng)葡萄糖酸濃度為0.4 mol/L 時(shí)，脫鈣率達(dá)到91.21%，是低濃度（0.1 mol/L）的4.5 倍，表明葡萄糖酸濃度對蝦殼脫鈣具有顯著影響作用。這主要?dú)w因于濃度增加，提高了整個(gè)酸浸體系中反應(yīng)底物的濃度，促進(jìn)葡萄糖酸鈣的生成，進(jìn)而提升了脫鈣效率。但當(dāng)酸濃度增加到0.5 mol/L 時(shí)，蝦殼脫鈣率基本不發(fā)生變化，反應(yīng)趨于平衡，因此選取葡萄糖酸濃度為0.4 mol/L 比較適合。

圖2 葡萄糖酸濃度對蝦殼脫鈣效果的影響Fig.2 Effects of gluconic acid concentration on decalcification rate

2.3.2反應(yīng)溫度對蝦殼脫鈣效果的影響 由圖3 可知，在25～ 30 ℃范圍內(nèi)，蝦殼脫鈣率隨著溫度上升而增加。在30 ℃時(shí)，蝦殼脫鈣率為91.21%；而當(dāng)溫度超過30 ℃，脫鈣率基本不發(fā)生太大變化。這主要由于較高溫度，會(huì)降低CO2的溶解度，大量上升氣泡會(huì)黏附蝦殼粉顆粒浮到表面，進(jìn)而影響葡萄糖酸的脫鈣效果。綜合考慮脫鈣率和能耗，確定最佳蝦殼脫鈣反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖3 反應(yīng)溫度對蝦殼脫鈣效果的影響Fig.3 Effects of reaction temperature on decalcification rate

2.3.3反應(yīng)時(shí)間對蝦殼脫鈣效果的影響 由圖4 可知，在2.0 h 以內(nèi)，脫鈣率隨著反應(yīng)時(shí)間延長而迅速增大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.0 h，對應(yīng)脫鈣率為91.21%；而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長至2.5 h，脫鈣率僅增長0.17%。這主要是因?yàn)樵黾臃磻?yīng)時(shí)間，有利于葡萄糖酸分子與蝦殼中鈣組分進(jìn)行充分反應(yīng)，產(chǎn)生葡萄糖酸鈣。但當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間后，蝦殼的鈣組分濃度大大減低，葡萄糖酸鈣的生成效率逐漸減小，最后脫鈣率趨于穩(wěn)定。因此，選擇2.0 h 作為最佳脫鈣反應(yīng)時(shí)間。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對蝦殼脫鈣效果的影響Fig.4 Effects of reaction time on decalcification rate

另外，蝦殼的酸浸脫鈣反應(yīng)是典型的固液反應(yīng)，其中碳酸鈣組分與葡萄糖酸的反應(yīng)較迅速，鈣的溶出動(dòng)力學(xué)主要受擴(kuò)散傳質(zhì)的控制，擴(kuò)散傳質(zhì)是產(chǎn)生的Ca2+通過液膜層或固膜層。如果酸浸脫鈣反應(yīng)受固膜擴(kuò)散控制，蝦殼脫鈣率和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系可以用浸出動(dòng)力學(xué)公式：1 -(2/3)N–(1–N)2/3=kt來表示[19]，其中N為蝦殼脫鈣率，k為反應(yīng)速率常數(shù)，t為反應(yīng)時(shí)間。而鈣的溶出動(dòng)力學(xué)可以用收縮核模型理論進(jìn)行描述，即在酸浸脫鈣過程中，由于葡萄糖酸作用，使得固體鈣組分以Ca2+形式從濃相（固相）擴(kuò)散到淡相（液相）中，該擴(kuò)散過程發(fā)生在固液兩相界面。

以1-(2/3)N-(1-N)2/3對反應(yīng)時(shí)間t作圖，鈣的固膜擴(kuò)散收縮核動(dòng)力學(xué)模型如圖5 所示。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明，葡萄糖酸的蝦殼脫鈣過程符合固膜擴(kuò)散收縮核動(dòng)力學(xué)模型，對應(yīng)的擬合方程線性相關(guān)性高，相關(guān)系數(shù)R2=0.942。

圖5 蝦殼脫鈣的固膜擴(kuò)散收縮核動(dòng)力學(xué)模型Fig.5 Solid film diffusion shrinkage core dynamics model for decalcification of shrimp shells

2.3.4料液比對蝦殼脫鈣效果的影響 由圖6 可知，當(dāng)料液比小于1∶20 時(shí)，脫鈣率隨著料液葡萄糖酸與蝦殼粉的接觸面積，從而改善了脫鈣效果。當(dāng)料液比超過1∶20 時(shí)，脫鈣率反而有所減低，可能是蝦殼中鈣組分已對葡萄糖酸達(dá)到飽和狀態(tài)，過高的料液比無法有效提升蝦殼脫鈣效果[20]。因此確定最佳料液比為1∶20。

圖6 料液比對蝦殼脫鈣效果的影響Fig.6 Effects of solid-liquid ratio on decalcification rate

2.4 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的蝦殼脫鈣效果

均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)是一種集數(shù)論原理和多元統(tǒng)計(jì)的多因素多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，與全面實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，其最大優(yōu)點(diǎn)是通過少數(shù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期[21-22]。本實(shí)驗(yàn)涉及4 個(gè)因素，每個(gè)因素有5 個(gè)水平，選用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)U10*(54)，僅需要10 組實(shí)驗(yàn)；若采用正交實(shí)驗(yàn)，則需要用L25(54)表，做25 組實(shí)驗(yàn)。通過DPS 7.05 軟件對均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，依據(jù)回歸方程對脫鈣率進(jìn)行預(yù)測，確定最佳理論反應(yīng)條件。

為綜合考慮各因素對蝦殼脫鈣效果的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)。選取推薦用表選擇第1、3、4、5 列，形成擬水平設(shè)計(jì)表，為方便擬合，對料液比進(jìn)行換算，如表1 所示。從均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)4（A1=0.05 g/mL，A2=25 ℃，A3=1.5 h，A4=0.5 mol/L）的脫鈣率最高，為92.1%。通過DPS 7.05 軟件分析，得到多元一次線性回歸方程：

表1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Uniform design tests results

經(jīng)方差分析得知，F(xiàn)=20.80、P=0.003 1 ＜ 0.01、復(fù)相關(guān)系數(shù)R為0.966 4，回歸關(guān)系極顯著，表明A1（料液比）、A2（反應(yīng)溫度）、A3（反應(yīng)時(shí)間）、A4（酸濃度）與蝦殼脫鈣率呈極顯著的回歸關(guān)系。

從回歸方程可知，A1、A2的系數(shù)為負(fù)，表明實(shí)驗(yàn)指標(biāo)隨著因素A1、A2的增加而減??；而A3、A4的系數(shù)為正，表明實(shí)驗(yàn)指標(biāo)隨著因素A3、A4的增加而增大。因此，在確定最佳理論工藝參數(shù)時(shí)，因素A1、A2應(yīng)取偏下限，即料液比為0.04（1∶25）g/mL，反應(yīng)溫度為25 ℃；因素A3、A4應(yīng)取偏上限，即反應(yīng)時(shí)間為2.5 h、酸濃度為0.5 mol/L，將以上各值帶入式（3），得到Y(jié)=93.45%，這一結(jié)果要優(yōu)于表1 中10 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，從公式（3）可知，A1、A2、A3、A4的系數(shù)分別為-424.564、-0.751、2.519和122.308，其中A1、A3、A4具有較大系數(shù)，表明A1、A3、A4的變化對Y值影響較大，為主要影響因素，這與2.3 的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的；A2的系數(shù)較小，表明A2的變化對Y值影響較小，為次要影響因素，與圖3 的結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了多元一次線性回歸方程的可靠性。

2.5 不同反應(yīng)條件對蝦殼脫鈣效果影響對比

根據(jù)式（3）得到的最佳反應(yīng)條件，與單因素確定的最佳條件和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對比，結(jié)果如圖7 所示?？梢钥闯?，單因素最佳條件1(0.05 g/mL、30 ℃、2.0 h、0.4 mol/L)下的蝦殼脫鈣率為（91.21 ± 0.40）%，均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)最佳條件2（A1=0.05 g/mL，A2=25 ℃，A3=1.5 h，A4=0.5 mol/L）下的蝦殼脫鈣率為（92.1 ± 0.21）%,而由回歸方程預(yù)測到的最佳反應(yīng)條件3 的脫鈣率則高達(dá)（93.78 ± 0.36）%,其結(jié)果優(yōu)于單因素考察最佳條件和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)最佳條件，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也優(yōu)于已有文獻(xiàn)報(bào)道。如于會(huì)國等[23]利用乳酸桿菌發(fā)酵對蝦殼脫鈣，選取發(fā)酵溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間72 h，蝦殼的脫鈣率僅為80.35%；李明華等[18]在超聲波輔助條件下優(yōu)化了檸檬酸脫鈣工藝，選定溫度50 ℃,反應(yīng)時(shí)間 1.5 h，對應(yīng)的蝦殼脫鈣率為93.85%。通過對比反應(yīng)條件可知，本研究采用該線性回歸模型優(yōu)化的工藝條件相對溫和，反應(yīng)時(shí)間適中，操作簡單，更具有實(shí)用價(jià)值。

圖7 不同反應(yīng)條件對蝦殼脫鈣效果的影響Fig.7 Effects of different reaction condition on decalcification rate

2.6 葡萄糖酸鈣的紅外光譜圖

為進(jìn)一步驗(yàn)證葡萄糖酸直接蝦殼脫鈣一步法制備葡萄糖酸鈣可行性，將制得脫鈣液經(jīng)冷凍干燥后，與溴化鉀混勻壓片進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果如圖8(a)所示。其中3 200～ 3 400 cm-1處較寬的吸收峰對應(yīng)—OH 的伸縮振動(dòng)吸收；2 938 cm-1為—CH2—的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 596 cm-1、1 437 cm-1為羧酸鹽的—COO-的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 140 cm-1、1 051 cm-1為C—OH 的伸縮振動(dòng)吸收峰。通過圖譜對比，制得樣品的譜圖與葡萄糖酸鈣標(biāo)準(zhǔn)紅外譜圖[10]（圖8(b)）是一致的。此外，通過元素分析結(jié)果（表2）可知，葡萄糖酸鈣的各元素比例與理論值基本一致，表明制備的葡萄糖酸鈣具有較好的純度，這也側(cè)面證明了通過葡萄糖酸直接蝦殼脫鈣一步法制備葡萄糖酸鈣是可行的。

圖8 樣品和葡萄糖酸鈣的紅外光譜Fig.8 The infrared spectrum of as-made sample and calcium gluconate

表2 樣品與葡萄糖酸鈣樣品的理論元素含量對比Table 2 Elemental analysis of as-made sample and calcium gluconate

3 結(jié)論

葡萄糖酸對蝦殼具有良好的脫鈣效果，通過單因素實(shí)驗(yàn)及均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，獲得蝦殼脫鈣的最佳反應(yīng)條件，即料液比為1∶25 (g/mL)，葡萄糖酸濃度為0.5 mol/L，在25 ℃反應(yīng)2.5 h，蝦殼的脫鈣率高達(dá)（93.78 ± 0.36）%，該脫鈣過程符合固膜擴(kuò)散收縮核動(dòng)力學(xué)模型。此外紅外結(jié)果和元素分析結(jié)果也表明，利用葡萄糖酸一步法制備的葡萄糖酸鈣具有較好的純度。該工藝反應(yīng)條件溫和、操作簡便、節(jié)能低耗，比較符合綠色環(huán)保的理念，可為開展蝦殼的資源化利用提供新思路和理論借鑒。