高素榮

摘 要 選取水體中上、中、下層魚（鰱、草魚、鯽）并抽取其尾動脈血液，提取上清液，測定SOD活性。試驗結(jié)果：鰱、草魚、鯽的SOD活性分別是6.354 U·mL-1、2.394 U·mL-1、4.783 U·mL-1;其中草魚的SOD活性顯著低于鰱（P<0.05），草魚與鯽間差異顯著（P<0.05），鰱與鯽間差異顯著（P<0.05）;鰱血液中SOD活性最高。

關(guān)鍵詞 鰱;草魚;鯽;血液;SOD活性

中圖分類號：S965 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.25.002

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是國際公認(rèn)的能夠有效清除自由基的酶。在1969年被McCord和Fridovich在牛血紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[1]，SOD是一種新型酶制劑，專一清除超氧陰離子（O2–）的關(guān)鍵酶。SOD在生物界分布極廣，幾乎從人到單細(xì)胞生物，從動物到植物，都有它的存在。SOD有多種抗氧化酶成分，能有效清除體內(nèi)破壞健康、導(dǎo)致疾病的自由基，將其分解成對機體無害的氧分子和水分子，并順利排除體外。SOD可有效清除體內(nèi)活性氧，減輕蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其他細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷和恢復(fù)紅細(xì)胞膜的氧化損害[2-3]。SOD活性在營養(yǎng)、醫(yī)療、疾病、陸生動物方面都有了很多的研究，在水生動物肝胰臟等組織SOD活性和SOD在有某些因素影響下的活性研究有較多文獻報道[4-8]，但水生動物血液中SOD在正常情況下的活性研究目前所見的報道和相關(guān)文獻很少。

隨著養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖密度不斷增加，魚類疾病害問題日益突出。漁藥的大量使用和濫用造成了養(yǎng)殖水體的環(huán)境惡化，漁藥殘留給食品安全帶來了極大的隱患[9]。目前，常規(guī)養(yǎng)殖中鰱已經(jīng)占重要養(yǎng)殖地位。免疫能力的強弱與SOD活性有著密切的關(guān)系[10]。本試驗測定鰱、草魚、鯽血液中SOD活性，并加以比較，尋找其理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗用魚

試驗鰱、草魚、鯽均購于榮昌縣梅石壩漁場。試驗前在水族箱內(nèi)暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間的水溫控制在22～24 ℃，DO 4.0～5.5 mg·L-1，增氧泵24 h不間斷充氧。每天投喂魚體總重5%的優(yōu)質(zhì)配合飼料（通威牌通用魚飼料，蛋白含量為28%）1次。

1.1.2? 試驗藥品及試劑

肝素（市售肝素凍干粉140單位/mg，1 g瓶裝，每瓶140 000單位），超氧化物歧化酶測定試劑盒（購于南京建成生物工程研究所），0.9%的生理鹽水（自配）。

1.1.3? 主要儀器設(shè)備

解剖工具1套、注射器、加樣器、高壓滅菌鍋、分光光度計、電子天平、離心機、水浴鍋、無菌操作臺等。

1.2? 方法

1.2.1? 生理鹽水的配制

稱取0.9 g氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100 mL。

1.2.2? 肝素生理鹽水溶液的配制

電子天平稱取0.1 g肝素凍干粉溶于100 mL生理鹽水中，完全溶解后即可。

1.2.3? ?抗凝管的制備

先配成肝素生理鹽水溶液，每管加0.1 mL橫向轉(zhuǎn)動離心管，使離心管管壁濕潤后放置低于80 ℃烤箱中烤干備用，可抗凝2～5 mL血液。

1.2.4? 血樣的采集

用5 mL注射器在試驗魚的尾部抽取動脈血液2～5 mL。

1.2.5? 血液的抗凝處理

把血液注入制備好的離心管中。

1.2.6? 血液的離心

把所采集的血樣放入離心機中離心（3 000 r·min-1，10 min）。

1.2.7? 血清的提取

把離心管中的上清液用注射器抽取出來放入比色管中待用。

1.2.8? SOD活性測定

采用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶測定試劑盒測定。按說明書配好試劑和顯色劑。測定時測定管和對照管平行加入（見表1）：1號試劑1.0 mL→測定管加血清8 ?L、對照管加蒸餾水8 ?L→2號試劑0.1 mL→3號試劑0.1 mL→4號試劑0.1 mL→充分混勻→置于37 ℃恒溫水浴40 min→對照管和測定管中各加2 mL顯色劑→混勻置于室溫10 min→波長于550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。

按公式（1）分別計算出鰱、草魚、鯽血液中SOD的活性。式中稀釋倍數(shù)包括反映系統(tǒng)的稀釋倍數(shù)和樣本測定前的稀釋倍數(shù)，本試驗的稀釋倍數(shù)為10。

SOD總活力（U·mL-1）=[（對照管吸光度-測定管吸光度）÷對照管吸光度]÷50%×稀釋倍數(shù) （1）

2? 結(jié)果與分析

經(jīng)測定得出鰱、草魚、鯽血液中SOD的活力見表2。試驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件分析。從表2中能看出，三者之間的關(guān)系：血液中SOD活性鰱比草魚高3.960（U·mL-1），差異性顯著（P<0.05），草魚比鯽低2.364（U·mL-1）性差異顯著（P<0.05），鰱與鯽高1.596（U·mL-1）（P<0.05）。試驗魚之間作比較，鰱SOD活性最強，草魚SOD活性最弱，可以說明鰱的免疫能力最強，草魚的免疫能力最弱。

3? 小結(jié)與討論

SOD是一種起源于生命體的活性物質(zhì)，是機體重要的抗氧化系統(tǒng)成員，作為一種特異性消除超氧化自由基的循環(huán)酶，對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能消除超氧陰離子自由基（O2-），主要負(fù)責(zé)過氧化和噬菌作用造成的細(xì)胞損害的防御作用[11]。SOD作為水生生物在水環(huán)境中受到表面活性劑污染脅迫的分子毒理學(xué)指標(biāo)具有一定可行性。SOD減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，SOD活性下降意味著自由基清除能力下降[12]。血清中活性較高的超氧化物歧化酶對維持白細(xì)胞的完整性與正常的吞噬功能具有重要意義[13]。

本試驗結(jié)果鰱、草魚、鯽血液SOD活性之間的關(guān)系從表2中可以看出：鰱血液SOD活性高于草魚血液SOD活性（P<0.05），草魚與鯽、鰱與鯽間血液SOD活性比較，差異顯著（P<0.05）。生物SOD活性越高，說明其清除自由基的能力越強，即免疫能力越強[14]。試驗魚血液SOD活性相比較，從中比較免疫能力：鰱>鯽>草魚。SOD是活性氧自由基（O2-）的天然消除劑，是抗氧化酶中最先與O2-酶類相結(jié)合，可作為機體非特異性免疫指標(biāo)，來評判免疫刺激因子對機體非特異性免疫力的影響[15]。本試驗結(jié)果顯示鰱的免疫能力最強，草魚最弱，鯽的免疫力介于與鰱與草魚之間。SOD的活性受多種因素的影響，已有研究表明[16]。從草魚、鰱、鯽的生活水層的pH、自身的生理條件不同來加以分析。1）3種魚所在的生活水層不同：在養(yǎng)殖水體中，不同水層的pH值也不同。鰱生活在水體的中上層，其pH誘導(dǎo)魚體O2-產(chǎn)生量與SOD對O2-的清除量處于動態(tài)平衡，細(xì)胞能進行正常的生理活動，機體處于健康狀態(tài)，表明鰱的免疫能力強。長期處于低pH值的環(huán)境中，因酸度過大時，魚體會產(chǎn)生大量的O2-，如果魚體沒有足夠的SOD來清除過多的O2-時，就會造成細(xì)胞的損害，細(xì)胞不能進行正常的生理活動，SOD活性降低或喪失，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡的嚴(yán)重后果。草魚生活在水體的中層，筆者認(rèn)為這是草魚血液中SOD活力很低的原因之一，也是引起草魚多病的因素。鯽生活在水體下層，水體下層pH值比中、上層高，其血液中SOD的活性比草魚高，比鰱低，SOD的活性隨水體pH值升高而增大，但到了一定的值時又會逐漸下降。鯽血液中SOD的活性應(yīng)是處于隨著pH值升高而下降的狀態(tài)，也就是血液中SOD的活性鯽比草魚高、比鰱低，這是筆者根據(jù)參考文獻[17]來推斷的。2）魚體生理條件不同：在同一水體中，魚體之間生理條件不同，則血液中SOD的活性也不相同。魚體內(nèi)產(chǎn)生的O2-量和SOD對其的清除量處于平衡之中，細(xì)胞的生理活動就能正常進行，魚體處于健康狀態(tài)。而平衡是相對的，鰱、草魚、鯽O2-和SOD之間的平衡度不等，試驗魚間比較存在著：鰱>鯽>草魚，即血液中SOD的活性鰱>鯽>草魚。筆者根據(jù)本試驗結(jié)果推測：養(yǎng)殖水體中鰱發(fā)病率相對較小，可減少治療魚病所用魚藥成本，同時提高魚類食品的質(zhì)量安全。

參考文獻：

[1]? 楊升東.超氧化物歧化酶的研究與應(yīng)用[J].化學(xué)與生物工程，2004（3）：7-9.

[2]? 高勇，孟憲軍.CPDA液保存庫血紅細(xì)胞SOD和ATP酶活性的變化[J].實用醫(yī)藥雜志，2006（7）：837.

[3]? 尹紹武，雷從改，黃海，等.點帶石斑魚不同組織同工酶的研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2006（9）：471-473.

[4]? 唐學(xué)璽，張培玉.蒽對黑魚君超氧化物歧化酶活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報，2000（3）：217-220.

[5]? 馮濤，鄭微云，郭祥群，等.苯并（a）芘對大彈涂魚肝臟超氧化物歧化酶活性的影響[J].臺灣海峽，2001（2）：182-186.

[6]? 雷鳴，廖柏寒，婁敏，等.LAS對澎澤鯽鰓及肝臟ATPase和SOD活性的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004（3）：272-274.

[7]? 沈盎綠，沈新強.柴油對斑馬魚超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的影響[J].海洋漁業(yè)，2005（4）：314-318

[8]? 余群，鄭微云，翁妍，等.石油污染對真鯛幼體中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的毒理效應(yīng).廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1999（3）：429-434.

[9]? 周維仁，劉濤，薛飛，等.氧化苦參堿對異育銀鯽血液非特異性免疫因子的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006（3）：271-275.

[10] Marcelo Mu?oz， RicardoCede?o， Jenny Rodr??guez， et al. Measurement of reactive oxygen intermediate production in haemocytes of the penaeid shrimp， Penaeus vannamei[J]. Aquaculture，2000（1-3）：89-107.

[11] 季高華，劉至治，冷向軍.飼料中添加β-葡聚糖和低聚果糖對中華鱉幼鱉生長和血清SOD、溶菌酶活力的影響[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2004（1）：36-40.

[12] 王艷萍，祁克宗，涂健，等.內(nèi)毒素對仔雞血漿SOD活性及MDA水平的影響[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2006（5）：63-65.

[13] 王宏偉，昌艷萍，楊健，等.飼料中硒元素對中華米蝦SOD活性的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005（5）：526-529，560.

[14] 王雷，李光友，毛遠(yuǎn)興，等.口服免疫型藥物對養(yǎng)殖中國對蝦病害防治作用的研究[J].海洋與湖沼，1994（5）：486-492.

[15] 韓英，張輝，王琨.亞硝態(tài)氮對鯉魚種血液SOD及GSH-Px的影響[J].淡水漁業(yè)，2007（1）：66-68.

[16] 汪開毓，耿毅，鐘妮娜.魚類應(yīng)激性出血癥的病理學(xué)研究[J].淡水漁業(yè)，2000（11）：28-31.

[17] 馬廣智，唐玫，徐軍.低pH對草魚鰓和肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2001（1）：23-25.

（責(zé)任編輯：敬廷桃）