伊思達(dá)，高懿，陳麗，黃金虎，王曉明，王麗平(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

腸球菌(Enterococcus)雖在人類和動物消化道內(nèi)廣泛定植，但也是造成人發(fā)生院內(nèi)感染的重要病原菌之一。臨床分離的腸球菌以屎腸球菌(E.faecium)和糞腸球菌(E.faecalis)為主，主要引起人泌尿系統(tǒng)、皮膚組織、腹腔和腦部感染。腸球菌有較為堅厚的細(xì)胞壁，能對許多抗生素產(chǎn)生固有耐藥性[1]。目前，因抗菌藥物的廣泛應(yīng)用造成的選擇性壓力，腸球菌的耐藥性也不斷增強(qiáng)，尤其是耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococci，VRE)的出現(xiàn)，給人類的感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)，目前VRE菌株已被WHO列為嚴(yán)重威脅人類健康的超級細(xì)菌之一[2-3]。中國耐藥監(jiān)測網(wǎng)2015—2018年的數(shù)據(jù)顯示，糞腸球菌對氨芐西林、高濃度慶大霉素、利福平、環(huán)丙沙星、紅霉素、呋喃妥因、替考拉寧的耐藥率均低于屎腸球菌，對氯霉素的耐藥率顯著高于屎腸球菌；糞腸球菌對呋喃妥因和氨芐西林的耐藥率仍保持較低水平，但對紅霉素和利福平的耐藥率均在55%以上[4-7]。近年來研究顯示，動物源性腸球菌不僅會導(dǎo)致動物出現(xiàn)相關(guān)感染，而且會成為腸道菌群中耐藥基因轉(zhuǎn)移的供體菌，由于腸球菌存在通過食物鏈傳播給人以及成為耐藥基因水平轉(zhuǎn)移供體庫的風(fēng)險，會對食品安全與人類臨床抗感染治療造成威脅，因而備受關(guān)注，故對糞腸球菌在內(nèi)的腸球菌進(jìn)行長期的耐藥性監(jiān)測也具有重要的公共衛(wèi)生意義[8-10]。

酰胺醇類抗生素(phenicols)包括氯霉素、甲砜霉素以及氟苯尼考，在臨床抗感染治療中對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌及支原體均有較強(qiáng)抗菌活性[11]。隨著該類抗菌藥在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用，動物源性糞腸球菌對其耐藥率也日趨上升[12-14]。腸球菌不僅是人畜共患機(jī)會致病菌，而且其耐藥相關(guān)可移動遺傳元件的種內(nèi)、種間的水平轉(zhuǎn)移可促進(jìn)耐藥性的水平擴(kuò)散，給動物和人類以及公共衛(wèi)生安全造成極大的威脅。因此，對動物源性糞腸球菌進(jìn)行長期的耐藥性監(jiān)測有助于我們掌握該菌耐藥性變遷的情況，可為抗菌藥物的合理使用提供參考，并進(jìn)一步為深入研究細(xì)菌耐藥產(chǎn)生和傳播機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2016—2017年間，在江蘇省蘇北地區(qū)10個豬場共采集300份肛門拭子樣品。其中，2016年采集120份樣品，2017年采集180份樣品。

1.2 主要試劑和藥品

四環(huán)素、紅霉素、青霉素G、萬古霉素、鏈霉素、慶大霉素，購自阿拉丁(Aladdin)公司；麻保沙星、利福平、氟苯尼考，購自阿達(dá)瑪斯(Adamas)公司；氨芐西林、利奈唑胺，購自麥克林(Macklin)公司；腸球菌肉湯、腸球菌瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯、陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯、腦心浸液瓊脂，購自青島海博生物；1×TE buffer、50×TAE(用前稀釋至1×)，購自 Biosharp 公司；2×TaqMaster Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Gold view核酸染料，購自南京百斯凱科技有限公司；DNA Maker、瓊脂糖，購自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定

取肛門拭子樣品于腸球菌肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，并于腸球菌瓊脂平板上分離培養(yǎng)，挑取菌落周圍變?yōu)楹稚木渑囵B(yǎng)，保存并粗提取菌株DNA用于糞腸球菌PCR反應(yīng)模板。其中特異性引物為：5′-ATCAAGTACAGTTAGTCTTTATTAG-3′和5′-ACGATTCAAAGCTAACTGAATCAGT-3′。目的片段大小為941 bp。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min[15]。

1.3.2 藥敏試驗

根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定了11種抗菌藥對臨床分離的豬源糞腸球菌及質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213(購自中國藥品生物制品檢定所)的最小抑菌濃度(MIC)[16]。

1.3.3 酰胺醇類耐藥基因檢測

采用PCR的方法檢測氟苯尼考耐藥糞腸球菌中酰胺醇類耐藥基因fexA、fexB、floR、cfr和optrA。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，加滅菌三蒸水至20 μL。按參考文獻(xiàn)合成的各基因引物序列及退火溫度，產(chǎn)物片段大小見表1。對擴(kuò)增的陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗證，確證為待檢基因。

表1 檢測耐藥基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌的分離率

2016—2017年從蘇北地區(qū)10個養(yǎng)豬場的300份豬肛門拭子中分離糞腸球菌230株，分離率為76.7%。其中2016年樣品中分離到89株糞腸球菌，2017年樣品中分離到141株糞腸球菌。

2.2 糞腸球菌對11種抗菌藥物的耐藥率分析

230株糞腸球菌對各種藥物的耐藥率情況見表2，其中，氟苯尼考耐藥菌株為223株，耐藥率高達(dá)97.0%，僅次于四環(huán)素(100%)和紅霉素(98.3%)，對其他藥物的耐藥率分別為慶大霉素78.7%、鏈霉素75.2%、麻保沙星70.9%、利奈唑胺54.8%、利福平30.4%、氨芐西林1.7%、青霉素G 0.4%，未檢測到萬古霉素耐藥菌株。

表2 豬源糞腸球菌臨床分離株對11種抗菌藥物的耐藥性 (n=230)

對臨床分離的糞腸球菌的多藥耐藥情況進(jìn)行分析，多藥耐藥菌株的分布情況如圖1所顯示，結(jié)果顯示所有耐藥糞腸球菌均為多藥耐藥菌株，其中大多數(shù)對5～8種藥物耐藥，尤以6耐為主，達(dá)27.8%(64株)，另有1株菌表現(xiàn)為同時對10種抗菌藥物耐藥。

圖1 豬源糞腸球菌的多藥耐藥菌株分布

2.3 不同年代分離糞腸球菌對11 種抗菌藥物的耐藥性比較

進(jìn)一步比較了2016和2017年分離的糞腸球菌對11種抗菌藥物的耐藥率(圖2)，結(jié)果顯示2017年分離的豬源糞腸球菌對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物青霉素G和人醫(yī)臨床常用的抗菌藥物利福平均高于2016年分離株，而對其他抗菌藥物的耐藥率略有下降或持平。

圖2 2016 年和2017 年分離糞腸球菌對常用抗菌藥物的耐藥率比較

2.4 豬源糞腸球菌酰胺醇類耐藥基因的檢出率分析

對230株糞腸球菌進(jìn)行耐藥基因fexA、fexB、floR、cfr、optrA的檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖3 豬源糞腸球菌的耐藥基因檢出數(shù)

223株氟苯尼考耐藥糞腸球菌中，30.5%(68/223)的菌株攜帶1種耐藥基因，55.2%(123/223)的耐藥菌株攜帶2種耐藥基因，12.1%(27/223)攜帶3 種耐藥基因， 0.9%(2/223)的菌株攜帶4種耐藥基因，1.4%(3/223)的菌株不攜帶上述任何一種耐藥基因。氟苯尼考耐藥的糞腸球菌耐藥基因譜型見表3所示，最常見的基因譜型為fexA+floR(44.8%)，其次為fexA(24.7%)，另有2 株糞腸球菌同時攜帶4 種酰胺醇類耐藥基因，表現(xiàn)分別為cfr+optrA+fexA+floR和optrA+fexA+fexB+floR。

表3 氟苯尼考耐藥糞腸球菌的酰胺醇類耐藥基因譜

3 討論

腸球菌因具有獨(dú)特的天然耐藥機(jī)制以及豐富的耐藥相關(guān)水平轉(zhuǎn)移元件，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等，易發(fā)生耐藥基因的水平傳播而獲得耐藥性，因此常被認(rèn)為是耐藥基因的傳遞體[20-21]，故了解腸球菌耐藥性變遷，遏制耐藥菌株流行傳播尤為重要。根據(jù)CHINET 的報導(dǎo)[4-7, 22]，糞腸球菌對紅霉素與利福平的耐藥率均處于一個比較高的水平(>55%)。本試驗中的豬源性糞腸球菌對紅霉素(98.3%)和利奈唑胺(54.8%)的耐藥率均高于同年人分離菌株對紅霉素(64.0%)與利奈唑胺(1.9%)的耐藥率，但人源性糞腸球菌對四環(huán)素的耐藥率(69.5%～81.8%)低于豬源性糞腸球菌(100%)[23-26]，推測其主要原因為人與豬抗菌藥物的用藥環(huán)境差異，并且由于近年來人醫(yī)抗感染治療中抗生素的使用管控較為嚴(yán)格，抗生素使用減少，而相對于人醫(yī)，獸醫(yī)抗感染治療仍存在著抗生素濫用、管控不嚴(yán)格等現(xiàn)象，也是豬源性糞腸球菌耐藥率普遍高于人源性糞腸球菌的重要原因。值得注意的是，豬源性糞腸球菌的氟苯尼考耐藥率高達(dá)97.0%，這種極高的耐藥率在之前的報道中從未出現(xiàn)過，可能與氟苯尼考作用獸醫(yī)常用廣譜抗生素廣泛用于豬的細(xì)菌性疾病的治療有關(guān)。在本次樣品中利奈唑胺耐藥菌株的分離率較高(54.8%)，而利奈唑胺作為人醫(yī)臨床專用抗菌藥物，未被批準(zhǔn)用于動物，其耐藥性的產(chǎn)生與菌株攜帶的耐藥基因optrA相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)該基因可同時使菌株對氟苯尼考的敏感性下降，故利奈唑胺耐藥性的產(chǎn)生可能與氟苯尼考在養(yǎng)豬業(yè)中的廣泛使用有關(guān)[19]。在本次蘇北豬場分離的豬源性糞腸球菌中未發(fā)現(xiàn)VRE，這并不意味著可以放松警惕，萬古霉素作為抗革蘭陽性菌感染最后一道防線，仍需要嚴(yán)格防控萬古霉素耐藥菌株以及萬古霉素耐藥基因的傳播以及轉(zhuǎn)移。多重耐藥的出現(xiàn)給臨床抗感染帶來了極大的挑戰(zhàn)[27-28]。在本次分離的豬源性糞腸球菌中多為多藥耐藥菌株，其中以5～8耐為主，這就表明一些傳統(tǒng)的聯(lián)合用藥治療方法可能會失去意義。上述信息應(yīng)該引起高度的重視，相關(guān)部門應(yīng)該完善相關(guān)法律法規(guī)嚴(yán)格控制抗生素的使用，一線醫(yī)護(hù)人員應(yīng)嚴(yán)格遵守抗生素使用規(guī)范并采取有效的感染防治措施防控、防止耐藥菌株大范圍傳播，科研人員應(yīng)定期實時跟蹤細(xì)菌耐藥性的變化。

由于氟苯尼考在獸醫(yī)臨床中的重要地位，本研究對其耐藥基因fexA、fexB、floR以及多藥耐藥基因cfr進(jìn)行進(jìn)一步檢測。fexA、fexB、floR為外排泵基因，其編碼的外排泵蛋白可同時介導(dǎo)氯霉素與氟苯尼考的耐藥；cfr基因編碼的則可以編碼23S rRNA甲基化酶并同時提高菌株對酰胺醇類、噁唑烷酮類、林可霉素類、截短側(cè)耳素類和鏈陽菌素A等5類藥物的耐藥水平[11-12,14,17]；optrA基因編碼的ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則能夠賦予對利奈唑胺和泰地唑胺以及酰胺醇類的可轉(zhuǎn)移抗性[19]。上述基因均可以通過轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒在多種類型的腸球菌，葡萄球菌以及一些陰性菌中轉(zhuǎn)移[29-30]。本試驗中，223株分離的氟苯尼考耐藥糞腸球菌中，152株攜帶2種以上的耐藥基因，說明了氟苯尼考耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，多種耐藥機(jī)制相互協(xié)同提升耐藥水平。有3株氟苯尼考耐藥菌中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)耐藥基因，推測可能有其他耐藥機(jī)制，值得進(jìn)一步探究。