董亞寧，王巧巧，李倩倩，苗秀秀，蘇鵬程，劉麗英，李顯耀*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院(動(dòng)物醫(yī)學(xué)院)，山東 泰安 271018；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

肌纖維作為肌肉的基本單位，其理化性質(zhì)是影響雞肉肉質(zhì)的重要因素[1]。肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育與肌肉品質(zhì)密切相關(guān)，在早期骨骼肌生長(zhǎng)過程中，肌纖維的發(fā)育受多個(gè)基因的調(diào)控，包括肌生長(zhǎng)抑制素基因(MSTN)、MRFs家族等，各基因相互作用調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育，影響肌肉質(zhì)量及肉品質(zhì)。

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN，)又稱生長(zhǎng)和分化因子8(growth differentiation factor-8，GDF-8)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族成員之一，是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，也可調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期[2-3]，抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)肌肉發(fā)育起關(guān)鍵作用。不同物種MSTN基因序列高度保守[4]，但在不同肌肉組織中的表達(dá)具有差異性。生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族包括生肌決定因子1(MyoD1)、肌細(xì)胞生成素(MyoG)、生肌調(diào)節(jié)因子5(Myf5)和生肌調(diào)節(jié)因子6(Myf6)4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[5-6]，具有組織表達(dá)特異性，在肌肉組織中高度表達(dá)[7]，并且不同肌肉組織中的表達(dá)同樣具有差異性[8]。MRFs家族內(nèi)各基因構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在動(dòng)物骨骼肌的發(fā)育中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[9-10]，共同參與肌細(xì)胞的增殖和分化[11-13]。

山東省地方雞品種豐富，生長(zhǎng)速度和雞肉品質(zhì)存在差異。其中濟(jì)寧百日雞主產(chǎn)于山東省濟(jì)寧市市中區(qū)，是蛋肉兼用型雞品種，以高產(chǎn)著稱，母雞一般在100 d左右開始產(chǎn)蛋(因而得名“百日雞”)。該品種適合散養(yǎng)，其肉質(zhì)鮮美，食量小，體小早熟，耐粗抗病，覓食力強(qiáng)。魯西斗雞主要分布在山東西南部曹州一帶，因其好斗而得名，是我國(guó)觀賞性珍貴雞種，該品種蛋白含量較高，有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[14]。汶上蘆花雞產(chǎn)于山東省汶上縣及相鄰的梁山、任城等縣市。該品種體型小，成熟早，產(chǎn)蛋率高而蛋小、耐粗飼、抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)，遺傳性能穩(wěn)定[15]。

為了探討雞早期肌肉纖維發(fā)育的規(guī)律，本試驗(yàn)選擇濟(jì)寧百日雞、汶上蘆花雞、魯西斗雞作為研究對(duì)象，分析了不同品種、不同周齡胸肌和腿肌Myf6、Myf5、MyoD1和MSTN等基因的mRNA表達(dá)水平，探索早期肌纖維發(fā)育時(shí)不同基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，為以后山東地方雞種選育和遺傳資源的開發(fā)利用提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

1日齡濟(jì)寧百日雞、汶上蘆花雞、魯西斗雞分別來自山東百日雞家禽育種有限公司、山東金秋農(nóng)牧科技有限公司和鄄城鴻翔牧業(yè)有限公司，每個(gè)品種選擇體重相近的公雞36只，在相同環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)。每個(gè)品種隨機(jī)選擇0 (1日齡)、1、2、3、4和5周齡各6只雞進(jìn)行屠宰，取左側(cè)胸肌和腿肌的相同部位2 cm×1.5 cm樣品，置于液氮中保存，用于提取RNA。

1.2 主要試劑和儀器

DNA Marker DM2000、TaqDNA Polymerase、dNTP等均購(gòu)自康為世紀(jì)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；熒光定量PCR儀(7500型)為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中雞的Myf6基因(登錄號(hào)：ENSGALG00000010936)、MyoD1基因(登錄號(hào)：ENSGALG00000006216)、Myf5基因(登錄號(hào)：ENSGALG00000028091)、MSTN基因(登錄號(hào)：ENSGALG00000039458)等基因序列，定量PCR引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，武漢擎科生物有限公司合成。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列

1.3.2 肌纖維直徑數(shù)據(jù)收集

制作石蠟切片，切片為6 μm，采用HE染色并在顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行觀察。選取切片的最佳部位，每張切片選取位置不少于5個(gè)。采用Image Pro Plus軟件和Image J對(duì)圖像進(jìn)行處理，采集圖像中的肌纖維直徑指標(biāo)。采集方法為：在圖片中連續(xù)測(cè)量相鄰的肌纖維，在5張圖片中測(cè)量肌纖維不少于40根，測(cè)定后計(jì)算出平均值代表每個(gè)個(gè)體的肌纖維直徑。

1.3.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)Invitrogen TRIzol的使用說明，分別用變性凝膠電泳和分光光度計(jì)DS-11(DeNovis，美國(guó))提取各樣品總RNA，并進(jìn)行完整性和濃度的檢測(cè)，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

按照試劑盒說明，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.3.4 熒光定量PCR

采用SYBR Green 染料法，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) 10 μL，PCR Forward primer 0.5 μL，PCR Reverse primer 0.5 μL， 滅菌雙蒸水(ddH2O)7 μL，DNA模板(cDNA)2 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性，50 ℃ 2 min；PCR反應(yīng)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；添加熔解曲線，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以β-actin作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR所有數(shù)據(jù)均采用Livak等[16]的2-ΔΔCt法分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用SAS軟件ANOVA法進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)分析同一品種、不同周齡的胸腿肌中Myf6、MyoD1、Myf5和MSTN基因表達(dá)水平的差異，以及同一周齡、不同品種的表達(dá)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地方雞種的肌纖維直徑比較

濟(jì)寧百日雞、汶上蘆花雞、魯西斗雞的胸肌和腿肌肌纖維直徑結(jié)果如圖1所示，HE染色圖略。隨時(shí)間增加，胸腿肌肌纖維逐漸增大，5周齡時(shí)，3個(gè)品種雞的胸腿肌肌纖維均達(dá)到最大，百日雞胸肌、腿肌肌纖維平均直徑分別為19.21和21.22 μm，斗雞胸肌、腿肌肌纖維平均直徑分別為22.00和24.30 μm，蘆花雞胸肌、腿肌肌纖維平均直徑分別為20.40和21.85 μm。在0周齡(1日齡)時(shí)，魯西斗雞的胸肌肌纖維直徑顯著大于百日雞和蘆花雞，百日雞的腿肌肌纖維直徑大于斗雞，差異顯著(P<0.05)。在1～4周齡時(shí)，百日雞、蘆花雞和斗雞胸腿肌的肌纖維直徑增加強(qiáng)度均較大。在4周齡時(shí)，百日雞和斗雞胸肌肌纖維直徑大于蘆花雞，斗雞的腿肌肌纖維直徑大于蘆花雞，差異顯著(P<0.05)；在5周齡時(shí)，斗雞胸肌、腿肌肌纖維直徑均大于蘆花雞和百日雞，差異顯著(P<0.05)。

小寫字母不同表示同一周齡不同品種間差異顯著(P<0.05)，字母相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 不同地方雞種的Myf6基因表達(dá)

2.2.1 Myf6基因在胸肌中的表達(dá)

濟(jì)寧百日雞、汶上蘆花雞、魯西斗雞胸肌Myf6基因在不同周齡的表達(dá)量存在差異，結(jié)果見圖2A。Myf6基因在汶上蘆花雞、濟(jì)寧百日雞胸肌中表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)。Myf6基因在汶上蘆花雞0～5周齡的表達(dá)量為1.429～2.501，4周齡時(shí)表達(dá)量顯著高于其他周齡，約為1、2和3周齡的2倍(P<0.05)，0周齡最低，顯著低于4周齡和5周齡(P<0.05)。Myf6基因在濟(jì)寧百日雞0～5周齡的表達(dá)量為0.929～2.607，3周齡表達(dá)顯著高于其他周齡(P<0.05)，2、4和5周齡的表達(dá)量明顯高于0周齡和1周齡(P<0.05)。Myf6基因在魯西斗雞0～5周齡的表達(dá)量為1.002～2.357，5周齡表達(dá)量顯著高于0、1、2、3和4周齡(P<0.05)，約為0、1、2、3和4周齡時(shí)的2倍。

不同品種同一周齡間的Myf6基因表達(dá)水平顯示，1周齡時(shí)，汶上蘆花雞Myf6基因的表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞和魯西斗雞(P<0.05)；3周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞胸肌中Myf6基因的表達(dá)顯著高于汶上蘆花雞和魯西斗雞(P<0.05)；4周齡時(shí)，汶上蘆花雞胸肌中Myf6基因的表達(dá)水平顯著高于魯西斗雞和濟(jì)寧百日雞(P<0.05)；5周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞胸肌中Myf6基因的表達(dá)水平顯著低于魯西斗雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。

2.2.2 Myf6基因在腿肌中的表達(dá)

0～5周齡3個(gè)品種腿肌中Myf6的表達(dá)水平結(jié)果見圖2B。Myf6基因在汶上蘆花雞腿肌中0～5周齡表達(dá)量為1.937～4.957，在0～4周齡時(shí)呈先增后減的趨勢(shì)，2周齡時(shí)達(dá)到最大值；在2周齡時(shí)汶上蘆花雞腿肌Myf6基因表達(dá)水平顯著高于其他周齡(P<0.05)，約為其他周齡的表達(dá)量的2倍。濟(jì)寧百日雞腿肌0～5周齡Myf6基因表達(dá)量分別為1.000～3.579，呈上升趨勢(shì)，5周齡時(shí)表達(dá)量顯著高于其他周齡(P<0.05)，達(dá)到0日齡的3.5倍。Myf6基因在魯西斗雞腿肌中各周齡的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

大寫字母不同表示同一品種不同周齡差異顯著(P<0.05)。下同

0周齡時(shí)，魯西斗雞和汶上蘆花雞Myf6基因表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞(P<0.05)，1周齡時(shí)，魯西斗雞和汶上蘆花雞Myf6基因明顯高于濟(jì)寧百日雞(P<0.05)；2周齡時(shí)，汶上蘆花雞Myf6基因表達(dá)水平極顯著高于濟(jì)寧百日雞和魯西斗雞(P<0.01)；5周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞腿肌中Myf6基因表達(dá)水平顯著高于魯西斗雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。

2.3 不同地方雞種的MyoD1基因表達(dá)

2.3.1 MyoD1基因在胸肌中的表達(dá)

在0～5周齡時(shí)，3個(gè)品種胸肌中MyoD1的表達(dá)水平結(jié)果見圖3A。MyoD1基因在濟(jì)寧百日雞胸肌0～5周齡表達(dá)量為0.27～0.663，0周齡表達(dá)量顯著高于其他周齡(P<0.05)，是1、2、4和5周齡表達(dá)量的3倍；3周齡時(shí)的表達(dá)量顯著高于1、2、4和5周齡(P<0.05)。MyoD1基因在魯西斗雞胸肌0～5周齡表達(dá)量分別為0.225～0.717，4周齡和5周齡的表達(dá)水平顯著高于0周齡和2周齡(P<0.05)。汶上蘆花雞胸肌中MyoD1基因表達(dá)量0～5周齡分別為0.456～1.410，呈先增后降的趨勢(shì)，3周齡時(shí)表達(dá)量最高，顯著高于其他周齡(P<0.05)，4周齡時(shí)表達(dá)量顯著高于1周齡時(shí)表達(dá)量(P<0.05)，約為1周齡表達(dá)量的2倍。

在0周齡時(shí)，MyoD1基因的表達(dá)水平在濟(jì)寧百日雞胸肌中顯著高于魯西斗雞和汶上蘆花雞(P<0.05)，汶上蘆花雞的表達(dá)水平顯著高于魯西斗雞(P<0.05)；在2和3周齡時(shí)，MyoD1基因的表達(dá)水平在汶上蘆花雞胸肌中顯著高于魯西斗雞和濟(jì)寧百日雞(P<0.05)；4周齡時(shí)，MyoD1基因的表達(dá)水平在汶上蘆花雞胸肌中顯著高于魯西斗雞和濟(jì)寧百日雞(P<0.05)，魯西斗雞顯著高于濟(jì)寧百日雞(P<0.05)；在5周齡時(shí)，MyoD1基因在汶上蘆花雞和魯西斗雞胸肌中的表達(dá)量明顯高于濟(jì)寧百日雞(P<0.05)。

2.3.2 MyoD1基因在腿肌中的表達(dá)

0～5周齡時(shí)，3個(gè)品種腿肌中MyoD1的表達(dá)水平結(jié)果見圖3B。MyoD1基因在汶上蘆花雞腿肌中0～5周齡表達(dá)量為0.677～1.225，濟(jì)寧百日雞腿肌中0～5周齡表達(dá)量為0.309～1.250，表達(dá)量呈先增后降趨勢(shì)，MyoD1基因在汶上蘆花雞腿肌2、3、4和5周齡表達(dá)水平顯著高于1周齡(P<0.05)，而2、3、4和5周齡之間無顯著差異。濟(jì)寧百日雞腿肌MyoD1基因表達(dá)量在0周齡和2周齡時(shí)顯著高于4和5周齡(P<0.05)，約為4和5周齡的2.5倍。MyoD1基因在魯西斗雞腿肌各周齡的表達(dá)量為0.272～1.742，4周齡的表達(dá)水平顯著高于0、1、2和3周齡(P<0.05)，表達(dá)量約為2和3周齡的3倍，0周齡和1周齡的7倍。

圖3 0～5周齡不同地方雞種的胸肌(A)和腿肌(B)中MyoD1基因表達(dá)量比較

在0和2周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞腿肌中MyoD1基因的表達(dá)水平顯著高于魯西斗雞(P<0.05)，汶上蘆花雞與濟(jì)寧百日雞無顯著差異(P>0.05)。1周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞腿肌中MyoD1基因表達(dá)水平顯著高于魯西斗雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。在4周齡時(shí)，魯西斗雞腿肌中MyoD1基因表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。5周齡時(shí)，MyoD1基因在濟(jì)寧百日雞腿肌中表達(dá)水平顯著低于魯西斗雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。

2.4 不同地方雞種的Myf5基因表達(dá)

2.4.1 Myf5基因在胸肌中的表達(dá)

在0～5周齡時(shí)，3個(gè)品種雞胸肌中Myf5的表達(dá)水平結(jié)果見圖4A。濟(jì)寧百日雞胸肌中Myf5基因表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，0～5周齡表達(dá)量為0.429～3.500，在3、4和5周齡的表達(dá)水平顯著高于0、1和2周齡(P<0.05)。魯西斗雞胸肌Myf5基因在各周齡表達(dá)量為1.714～5.543，0周齡時(shí)表達(dá)水平顯著低于1周齡(P<0.05)，顯著高于5周齡(P<0.05)，1、2、3和4周齡的表達(dá)量為5周齡的3倍以上。Myf5基因在汶上蘆花雞胸肌中0～5周齡表達(dá)量分別為0.843～4.357，呈先增后減的趨勢(shì)，2和4周齡的表達(dá)水平顯著高于0、1、3和5周齡(P<0.05)。

在0、1和3周齡時(shí)，魯西斗雞胸肌中Myf5基因表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。在2周齡時(shí)，魯西斗雞和汶上蘆花雞胸肌中Myf5基因表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞(P<0.05)。5周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞胸肌中Myf5基因表達(dá)水平顯著高于汶上蘆花雞和魯西斗雞(P<0.05)。

2.4.2 Myf5基因在腿肌中的表達(dá)

在0～5周齡時(shí)，3個(gè)雞品種腿肌中Myf5的表達(dá)水平結(jié)果見圖4B。在魯西斗雞腿肌中Myf5基因的表達(dá)水平呈先降后增的趨勢(shì)，各周齡表達(dá)量為4.167～8.650；魯西斗雞腿肌中Myf5基因0、1和2周齡時(shí)表達(dá)水平較高，在3周齡時(shí)表達(dá)水平顯著低于0、1、2和5周齡(P<0.05)；魯西斗雞腿肌中Myf5基因3周齡時(shí)表達(dá)水平約低于0、1和2周齡的1倍。Myf5基因在汶上蘆花雞腿肌中表達(dá)量為1.427～5.083，呈下降趨勢(shì)，0周齡時(shí)表達(dá)水平最高且顯著高于3、4和5周齡(P<0.05)，3、4和5周齡時(shí)表達(dá)水平約低于0周齡時(shí)表達(dá)量的2倍。在濟(jì)寧百日雞腿肌中Myf5基因表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，0周齡時(shí)濟(jì)寧百日雞腿肌內(nèi)Myf5基因表達(dá)水平顯著低于3、4和5周齡(P<0.05)。

圖4 0～5周齡不同地方雞種的胸肌(A)和腿肌(B)中Myf5基因表達(dá)量比較

在0、1、2和5周齡時(shí)，魯西斗雞腿肌中Myf5基因表達(dá)水平明顯高于濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。在0周齡時(shí)，汶上蘆花雞胸肌中Myf5基因表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞(P<0.05)。在3周齡時(shí)，3個(gè)品種雞腿肌中Myf5基因表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。在5周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞腿肌中的表達(dá)水平顯著高于汶上蘆花雞(P<0.05)。

2.5 不同地方雞種的MSTN基因表達(dá)

2.5.1 MSTN基因在胸肌中的表達(dá)

在0～5周齡時(shí)，3個(gè)雞品種胸肌中MSTN的表達(dá)水平結(jié)果見圖5A。在濟(jì)寧百日雞胸肌中MSTN基因的表達(dá)水平整體呈上升趨勢(shì)，0～5周齡表達(dá)量為0.762～6.569，4和5周齡時(shí)的表達(dá)水平顯著高于0、1、2和3周齡(P<0.05)。在魯西斗雞胸肌中MSTN基因的表達(dá)量為1.064～6.002，4周齡時(shí)的表達(dá)水平顯著高于其他周齡(P<0.05)。汶上蘆花雞胸肌中MSTN基因表達(dá)水平呈先增后降的趨勢(shì)，表達(dá)量為0.759～3.949，1周齡時(shí)的表達(dá)水平顯著高于其他周齡(P<0.05)。

圖5 0～5周齡不同地方雞種的胸肌(A)和腿肌(B)中MSTN基因表達(dá)量比較

在1周齡時(shí)，魯西斗雞胸肌中MSTN基因的表達(dá)水平顯著低于濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。2周齡時(shí)，魯西斗雞胸肌中MSTN基因的表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。3和4周齡時(shí)，汶上蘆花雞胸肌中MSTN基因表達(dá)水平顯著低于濟(jì)寧百日雞和魯西斗雞(P<0.05)，濟(jì)寧百日雞和魯西斗雞胸肌中MSTN基因表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。5周齡時(shí)，濟(jì)寧百日雞胸肌中MSTN基因表達(dá)水平顯著高于魯西斗雞和汶上蘆花雞(P<0.05)。

2.5.2 MSTN基因在腿肌中的表達(dá)

0～5周齡時(shí)，3個(gè)雞品種腿肌中MSTN基因的表達(dá)水平結(jié)果見圖5B。在濟(jì)寧百日雞腿肌中MSTN基因表達(dá)量0～5周齡為0.712～3.900，呈先增加后降低的趨勢(shì)，4周齡時(shí)MSTN表達(dá)水平顯著高于0、1、2、3和5周齡(P<0.05)，約為0、1、2、3和5周齡的3倍。魯西斗雞腿肌中MSTN基因表達(dá)量為0.735～5.250，大體呈先增后減趨勢(shì)，4周齡時(shí)MSTN基因表達(dá)水平顯著高于其他周齡(P<0.05)，其余周齡之間無顯著差異。汶上蘆花雞腿肌中MSTN基因表達(dá)水平穩(wěn)定，不同周齡間無顯著差異(P>0.05)。

在0～3周齡時(shí)，3個(gè)雞品種腿肌中MSTN基因表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。在魯西斗雞腿肌中4周齡MSTN基因表達(dá)水平顯著高于濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞(P<0.05)，濟(jì)寧百日雞中的表達(dá)水平顯著高于汶上蘆花雞(P<0.05)。在5周齡時(shí)3個(gè)地方雞種腿肌中MSTN基因表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 MRFs家族的表達(dá)調(diào)控

胚胎期Myf5和MyoD1基因調(diào)控骨骼肌發(fā)育，Myf5首先在前體肌細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控MyoD1基因的表達(dá)。Myf5基因?qū)﹄u體重等生長(zhǎng)性狀和肌纖維的直徑、密度等組織學(xué)性狀有顯著影響[17]。王鑫等[18]報(bào)道Myf5和MyoD1在綿羊不同組織中的表達(dá)顯示，Myf5、MyoD1在肌肉組織中的表達(dá)量最高。

本試驗(yàn)中相同周齡不同種間比較，魯西斗雞胸腿肌中Myf5基因的表達(dá)水平高于汶上蘆花雞和濟(jì)寧百日雞，且魯西斗雞胸腿肌中MyoD1的表達(dá)水平在4周齡、5周齡時(shí)較高，由此，可以推測(cè)Myf5和MyoD1基因的表達(dá)在魯西斗雞發(fā)育早期影響骨骼肌的生長(zhǎng)。3個(gè)雞種胸腿肌中Myf5、MyoD1基因的表達(dá)模式不同，兩者互相影響，共同調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育。Myf5基因在汶上蘆花雞和魯西斗雞腿肌中表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，這與張濤等[19]的研究一致。在本試驗(yàn)中，雞發(fā)育早期，濟(jì)寧百日雞胸腿肌中Myf5基因表達(dá)趨勢(shì)逐漸升高，MyoD1的表達(dá)趨勢(shì)逐漸降低，推測(cè)可能是受MSTN基因調(diào)控的影響。

雞肌肉Myf6基因主要是在出殼后受到Myf5調(diào)控，激活和表達(dá)后調(diào)控，并參與次級(jí)肌纖維的形成從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肌肉的調(diào)控，其與肌纖維類型的轉(zhuǎn)化有關(guān)。Myf6基因突變引起雞肌纖維密度、直徑和機(jī)體性狀的改變[20]。本項(xiàng)研究的結(jié)果顯示Myf5基因表達(dá)水平在3個(gè)地方品種出殼后胸肌中1～4周齡持續(xù)升高，其中汶上蘆花雞在2周齡時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高，Myf6基因的表達(dá)水平在4周齡時(shí)達(dá)到最高，可以推測(cè)出，Myf5基因可以激活Myf6的表達(dá)特別是在汶上蘆花雞中，從而參與肌纖維類型的轉(zhuǎn)化。0～5周齡時(shí)，Myf6基因在3個(gè)地方雞種的胸腿肌中的整體表達(dá)水平相近，其中表達(dá)規(guī)律不一致的地方可能是由于胸肌、腿肌起源的差異造成的，胸肌和腿肌分別是由軸下肌節(jié)的成肌細(xì)胞融合和肢芽處分化而成[21]。

3.2 肌肉生長(zhǎng)抑制素MSTN基因的表達(dá)

MSTN基因?qū)趋兰“l(fā)育具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。該基因在不同組織中表達(dá)差異，調(diào)控骨骼肌組織和脂肪細(xì)胞的增殖和分化[22]。在本試驗(yàn)中，0～4周齡，魯西斗雞胸肌中MSTN基因表達(dá)水平隨日齡的增加而升高，表達(dá)量在4周齡時(shí)達(dá)到最高，與魯西斗雞胸肌中Myf5的表達(dá)趨勢(shì)相反，與魯西斗雞胸肌中Myf6和MyoD1的表達(dá)趨勢(shì)相同；濟(jì)寧百日雞胸肌中MSTN基因表達(dá)水平隨日齡的增加而升高，但與MRFs基因表達(dá)水平的趨勢(shì)變化沒有明顯關(guān)聯(lián)。結(jié)果說明MSTN與Myf6和MyoD1的基因互作在魯西斗雞早期肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，這種互作可能與汶上蘆花雞和濟(jì)寧百日雞不同。汶上蘆花雞、濟(jì)寧百日雞和魯西斗雞腿肌中MSTN基因表達(dá)水平低于胸肌，猜測(cè)可能是由于腿肌運(yùn)動(dòng)量較高，從而使MSTN基因表達(dá)量降低。

4 結(jié)論

Myf5、Myf6、MyoD1和MSTN基因在3個(gè)地方雞種中均呈現(xiàn)出不同的表達(dá)調(diào)控模式，Myf6和Myf5的互作在汶上蘆花雞胸肌中起重要作用；MSTN在胸肌、腿肌中表達(dá)模式不同，MSTN與Myf6和MyoD1的互作在魯西斗雞早期肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。MSTN在汶上蘆花雞、濟(jì)寧百日雞和魯西斗雞腿肌中表達(dá)水平低于胸肌。本研究結(jié)果為地方雞種的開發(fā)利用和分子標(biāo)記輔助肉品質(zhì)性狀的選擇提供了相關(guān)依據(jù)，基因間的具體互作方式還有待進(jìn)一步研究。