楊紅玉，張敏，馬超鋒，閆文朝

(1. 南陽(yáng)農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473000；2. 焦作市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 焦作 454150；3. 信陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽(yáng) 464000；4. 河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

肉孢子蟲(chóng)病是由肉孢子蟲(chóng)(Sarcocystis)寄生于多種宿主的肌肉而引起的一種人獸共患原蟲(chóng)病，豬、牛、羊和鳥(niǎo)類等多種動(dòng)物均可感染。肉孢子蟲(chóng)屬于孢子蟲(chóng)綱、真球蟲(chóng)目、肉孢子蟲(chóng)科。肉孢子蟲(chóng)屬有200多個(gè)蟲(chóng)種，不同蟲(chóng)種的中間宿主和終末宿主也存在差異。一些蟲(chóng)種感染動(dòng)物后不表現(xiàn)明顯癥狀，而有些蟲(chóng)種可對(duì)中間宿主表現(xiàn)明顯致病性，引起動(dòng)物貧血、發(fā)熱、嗜酸性粒細(xì)胞肌炎、流產(chǎn)或者死亡。人因食用含有蟲(chóng)體的肉制品主要是豬肉而感染，出現(xiàn)發(fā)熱、惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀[1-2]。因此，開(kāi)展豬的肉孢子蟲(chóng)調(diào)查和研究具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和公共衛(wèi)生意義。

豬是肉孢子蟲(chóng)的中間宿主。根據(jù)報(bào)道，豬有3種肉孢子蟲(chóng)，米氏肉孢子蟲(chóng)(S.miescheriana)、豬人肉孢子蟲(chóng)(S.suihominis)和豬貓肉孢子蟲(chóng)(S.porcifelis)，其中米氏肉孢子蟲(chóng)和豬人肉孢子蟲(chóng)流行最為廣泛且致病性最強(qiáng)，曾引起豬場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)病暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)較大危害和損失[1，3]。本研究采用劉婕等[4]開(kāi)發(fā)的豬源肉孢子蟲(chóng)雙重套式PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)河南省11個(gè)地市62家屠宰場(chǎng)開(kāi)展生豬肉孢子蟲(chóng)感染情況調(diào)查，以期掌握河南省豬的肉孢子蟲(chóng)感染情況，為該地區(qū)肉孢子蟲(chóng)病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及處理

2018年6月—2019年10月，在河南省11個(gè)地市62個(gè)屠宰場(chǎng)采集膈肌樣品2 038份，每份5～8 g，登記樣品來(lái)源(年存欄大于500頭為規(guī)模場(chǎng)，少于500頭為散養(yǎng)戶)，冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，統(tǒng)一編號(hào)登記，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2 主要檢測(cè)試劑

普通Taq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、10×緩沖液、瓊脂糖等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；組織細(xì)胞DNA提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；豬源肉孢子蟲(chóng)雙重套式PCR檢測(cè)試劑盒由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；LC-800低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)；PCR儀(德國(guó)Biometre公司)；Eppendorf 不同量程單道移液器及25～300 μL多道移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(以色列DNA公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)等。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)[4]的報(bào)道米氏肉孢子蟲(chóng)和豬人肉孢子蟲(chóng)特異引物(如表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 豬源肉孢子蟲(chóng)雙重套式PCR檢測(cè)引物

1.5 檢測(cè)方法

將采集的樣品剪成小塊放入離心管中，隨后加入液體在全自動(dòng)樣品快速研磨儀上制成勻漿；采用組織細(xì)胞DNA提取試劑盒提取處理過(guò)樣品的總DNA，操作方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；將提取的總DNA作為模板，采用文獻(xiàn)[4]建立的肉孢子蟲(chóng)雙重套式PCR方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，米氏肉孢子蟲(chóng)和豬人肉孢子蟲(chóng)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分別為415和591 bp。

反應(yīng)條件：第一輪擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。第二輪PCR 擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.6 檢測(cè)數(shù)據(jù)分析

結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，分別對(duì)不同地區(qū)屠宰場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)場(chǎng)陽(yáng)性率和樣品陽(yáng)性率、不同規(guī)模豬群肉孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率、不同季節(jié)屠宰場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析差異顯著性，P<0.05時(shí)差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南省屠宰場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)總體感染情況

從圖1可以看到，本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的只有米氏肉孢子蟲(chóng)(415 bp)。本次檢測(cè)調(diào)查河南省11個(gè)地市的62個(gè)屠宰場(chǎng)，肉孢子蟲(chóng)陽(yáng)性場(chǎng)37個(gè)，平均場(chǎng)陽(yáng)性率為59.7%，最高的為駐馬店、商丘和鄭州，均為66.7%，其次為信陽(yáng)，為62.5%；場(chǎng)陽(yáng)性率最低的為安陽(yáng)和漯河，陽(yáng)性率均為33.3%。2 038份樣品的平均陽(yáng)性率為29.4%，南陽(yáng)、駐馬店、信陽(yáng)、鄭州、周口和新鄉(xiāng)樣品陽(yáng)性率均超過(guò)30%，周口樣品陽(yáng)性率最高，為37.1%；陽(yáng)性率最低為漯河和安陽(yáng)，分別為為10.5%和11.1%(見(jiàn)表2)。χ2檢驗(yàn)分析表明，河南不同地區(qū)屠宰場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)場(chǎng)陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)，不同地區(qū)間樣品陽(yáng)性率均差異極顯著(P<0.01)。

表2 樣品來(lái)源及抗體陽(yáng)性率

M．DL2000 DNA Marker；1～6.被檢樣品；7.陽(yáng)性對(duì)照；8.陰性對(duì)照

2.2 河南省不同規(guī)模豬場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)感染情況

本次調(diào)查根據(jù)豬的來(lái)源，分為規(guī)模場(chǎng)(存欄500頭以上)和散養(yǎng)戶(存欄500頭以下)。從表3可以看出，散養(yǎng)戶的肉孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率(32.3%)略高于規(guī)模場(chǎng)(27.7%)。χ2檢驗(yàn)分析表明，不同規(guī)模豬場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)。

表3 不同場(chǎng)點(diǎn)類型豬場(chǎng)肉孢子蟲(chóng)感染率

2.3 河南省屠宰場(chǎng)不同季節(jié)豬肉孢子蟲(chóng)感染情況

本次屠宰場(chǎng)生豬肉孢子蟲(chóng)感染調(diào)查，每個(gè)季節(jié)均有陽(yáng)性檢出，其中，春季最高，達(dá)到33.8%，冬季最低為26.1%(見(jiàn)表4)。χ2檢驗(yàn)分析表明，不同季節(jié)豬群肉孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)。

表4 屠宰場(chǎng)不同季節(jié)肉孢子蟲(chóng)感染率

3 討論

肉孢子蟲(chóng)病是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病，感染后會(huì)對(duì)人體健康造成一定的危害。牛、羊、豬等動(dòng)物是肉孢子蟲(chóng)傳播的中間宿主，與人類密切接觸，因此查清肉孢子蟲(chóng)的感染狀況，有重要公共衛(wèi)生意義。豬肉因其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而為人們所喜愛(ài)，我國(guó)每人年平均豬肉消費(fèi)量為27.1 kg(2019年)，豬肉是國(guó)人餐桌的主要肉類。2019全年，河南省生豬出欄量達(dá)3 170萬(wàn)頭，對(duì)屠宰生豬開(kāi)展肉孢子蟲(chóng)感染調(diào)查有重要的公共衛(wèi)生意義。本次共調(diào)查11個(gè)地區(qū)的62個(gè)屠宰場(chǎng)，場(chǎng)陽(yáng)性率為59.7%，樣品陽(yáng)性率為29.4%；這與曹謙[5]調(diào)查的青海同仁縣隆務(wù)地區(qū)豬感染率83.15%，馮成蘭等[6]調(diào)查的青海共和地區(qū)屠宰生豬感染率61.91%，周偉業(yè)[7]調(diào)查的青海冷湖地區(qū)的感染率47.34%，王榮菊等[8]調(diào)查的青海西寧屠宰場(chǎng)豬感染率44%相比，都要低；與薛瑞等[9]2018年調(diào)查的河南洛陽(yáng)豬源肉孢子蟲(chóng)感染率26.8%接近；遠(yuǎn)高于李明偉等[10]對(duì)湛江市豬肉孢子蟲(chóng)調(diào)查的感染率2.05%，張浩吉等[11]對(duì)廣州地區(qū)豬肉孢子蟲(chóng)調(diào)查的感染率0.7%，李小軍等[12]對(duì)河南豫北地區(qū)豬肉孢子蟲(chóng)調(diào)查的感染率0.238%。需要說(shuō)明的是以上調(diào)查所采用的方法均是鏡檢壓片法，檢測(cè)結(jié)果靠主觀判斷，與檢測(cè)者水平有較大關(guān)系，存在一定誤差。周望平等[13]采用ELISA 方法對(duì)湖南地區(qū)開(kāi)展豬肉孢子蟲(chóng)病血清學(xué)調(diào)查，感染率為4.4%，低于本次調(diào)查的感染率。本次調(diào)查肉孢子蟲(chóng)感染情況采用的雙重套式PCR檢測(cè)方法，具有敏感、特異和快捷等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肌肉組織和血液等樣品中肉孢子蟲(chóng)的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，可以為豬肉孢子蟲(chóng)病診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供高效的檢測(cè)手段和方法，可以大范圍推廣應(yīng)用。

本次調(diào)查將根據(jù)屠宰場(chǎng)豬的來(lái)源，將豬群劃分為規(guī)模場(chǎng)和散養(yǎng)戶，均有肉孢子蟲(chóng)陽(yáng)性檢出，說(shuō)明不同場(chǎng)點(diǎn)豬場(chǎng)均有感染，分析散養(yǎng)戶陽(yáng)性率高于規(guī)模場(chǎng)可能與規(guī)模場(chǎng)大多集約化養(yǎng)殖，有效切斷了中間宿主與終末宿主的聯(lián)系有關(guān)。從本次調(diào)查結(jié)果來(lái)看，河南省豬群一年四季均有肉孢子蟲(chóng)感染，但是不同季節(jié)感染率有差異，春季感染率最高，夏季、秋季和冬季感染率較接近，其中冬季感染率最低。當(dāng)前還沒(méi)有特效藥物治療肉孢子蟲(chóng)病，防治肉孢子蟲(chóng)病主要采取綜合性防控措施切斷傳播途徑：一是豬場(chǎng)禁止飼養(yǎng)犬貓，犬貓作為肉孢子蟲(chóng)的終末宿主，在肉孢子蟲(chóng)的感染中起到重要作用；二是病死動(dòng)物及時(shí)處理，禁止用生肉或者下水飼喂犬貓等動(dòng)物。