郭苗苗 王中豪 張?zhí)旌?吉利輝 徐桂芝

（1. 省部共建電工裝備可靠性與智能化國家重點實驗室（河北工業(yè)大學(xué)） 天津 300130 2. 河北工業(yè)大學(xué)天津市生物電工與智能健康重點實驗室 天津 300130）

0 引言

經(jīng)顱磁刺激技術(shù)是一種無創(chuàng)、非侵入式的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)[1-2]，其利用電磁感應(yīng)原理，將腦組織置于脈沖電流產(chǎn)生的時變磁場之下[3-4]，在大腦皮層中誘導(dǎo)產(chǎn)生感應(yīng)電場，促使神經(jīng)元發(fā)生迅速的去極化，從而引起某些生理反應(yīng)，達(dá)到調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)及其認(rèn)知功能的效果[5-6]。經(jīng)顱磁刺激技術(shù)作為重要的神經(jīng)調(diào)控手段被廣泛用于抑郁癥、精神分裂癥及阿爾茨海默癥等疾病的治療與研究中[7-8]。

重復(fù)性經(jīng)顱磁刺激（repetitive Transcranial Magnetic Stimulation, rTMS）是重要的經(jīng)顱磁刺激模式之一，已發(fā)展成為重要的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)并廣泛使用于臨床診療中[9]。Theta節(jié)律刺激（Theta Burst Stimulation, TBS）是模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)動作電位爆發(fā)性放電模式而改進(jìn)的新興rTMS模式[10]。標(biāo)準(zhǔn)的rTMS是以一定頻率發(fā)放脈沖刺激，而TBS以簇狀或叢狀的形式發(fā)放刺激，它的叢間刺激頻率為5Hz、叢內(nèi)頻率為50Hz。TBS可分為連續(xù)性Theta節(jié)律刺激（continuous Theta Burst Stimulation, cTBS）和間斷性Theta節(jié)律刺激（intermittent Theta Burst Stimulation, iTBS）[10]。cTBS連續(xù)不間斷地發(fā)放叢刺激，作用時間通常為20～40s；iTBS每隔8s發(fā)放一段2s的叢刺激；iTBS和cTBS在臨床和研究中應(yīng)用廣泛，iTBS能夠增加皮層興奮性，而cTBS能夠降低皮層興奮性[9-10]。與標(biāo)準(zhǔn)的rTMS相比，TBS可以以較低的刺激強度在較短時間內(nèi)對特定神經(jīng)元集群產(chǎn)生持久的后效應(yīng)，被認(rèn)為是更加有效的刺激手段[10]。

工作記憶（Working Memory, WM）是認(rèn)知心理學(xué)中的重要概念，是一種對信息進(jìn)行短時加工存儲的容量有限的記憶系統(tǒng)，在許多復(fù)雜的認(rèn)知活動中起重要作用。工作記憶障礙是神經(jīng)精神類疾病如阿爾茨海默癥的主要臨床表現(xiàn)之一。近年來，TMS結(jié)合在體多通道電生理記錄技術(shù)探索工作記憶神經(jīng)電生理活動的研究方法發(fā)展迅速。K. Wimmer等[11]研究表明，前額葉皮層（Prefrontal Cortex, PFC）是工作記憶功能的主要責(zé)任腦區(qū)之一。S. Laroche等[12]發(fā)現(xiàn)，大鼠前額葉皮層的功能異常導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。認(rèn)知功能障礙是神經(jīng)精神類疾病的顯著癥狀之一，工作記憶障礙則是認(rèn)知功能障礙的主要表現(xiàn)[13-15]，陳忠等[16]研究表明，通過TMS刺激WM相關(guān)腦區(qū)能夠有效改善工作記憶障礙等癥狀。Guo Zhiwei 等[17]發(fā)現(xiàn)，用5Hz高頻rTMS作用于左側(cè)背外側(cè)前額葉皮層能夠改善由睡眠剝奪導(dǎo)致的工作記憶障礙。S. De Witte等[18]證實了iTBS能改善抑郁癥患者的壓力恢復(fù)過程。F. Di Lorenzo等[19]將iTBS作用于小腦-丘腦皮質(zhì)通路，證實了iTBS能夠有效調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元功能，從而促進(jìn)阿爾茨海默癥的治療。C. M. Cheng等[20]將iTBS、cTBS以及二者結(jié)合的模式應(yīng)用于抗藥性抑郁癥治療中。研究結(jié)果表明，左前額葉的iTBS相比于其他兩種方法更有效，能夠顯著改進(jìn)患者工作記憶的執(zhí)行能力。

TMS在神經(jīng)精神類疾病的治療和調(diào)控領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其中，TBS模式能在短期作用后對皮層興奮性產(chǎn)生更有效的影響，在神經(jīng)調(diào)控中具有很好的應(yīng)用前景。但TMS對工作記憶功能的作用機制尚無具體定論，其仍是一個復(fù)雜的問題；且各模式及其不同參數(shù)TMS對神經(jīng)系統(tǒng)的影響差異較大，目前尚無公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，在實際的應(yīng)用中仍存在一定的盲目性[21]。因此，探究TMS技術(shù)對WM的調(diào)控機制有重要的臨床意義。

腦網(wǎng)絡(luò)是近年來新興的腦科學(xué)前沿領(lǐng)域，其中，腦功能網(wǎng)絡(luò)是依賴于神經(jīng)信號的腦網(wǎng)絡(luò)，不同層次神經(jīng)信號的腦功能網(wǎng)絡(luò)反映了不同水平神經(jīng)單元的功能連接關(guān)系。局部場電位（Local Field Potential, LFPs）能夠反映神經(jīng)元的局部網(wǎng)絡(luò)活動狀態(tài)。大量研究表明，LFPs信號中的θ 頻段以及γ 頻段的信號參與了哺乳動物工作記憶功能編碼[22-26]。在體多通道電生理記錄技術(shù)能夠獲得實驗對象大腦某些區(qū)域的LFPs。LFPs能夠反映神經(jīng)元局部網(wǎng)絡(luò)的活動狀態(tài)且LFPs信號相對其他信號有更好的行為特異性及時空分辨率。腦功能網(wǎng)絡(luò)的指標(biāo)主要有皮爾森相關(guān)系數(shù)、相干性、相鎖值、互信息以及因果關(guān)系等。線性相關(guān)程度是一種重要的變量之間關(guān)系的評估方法，皮爾森相關(guān)系數(shù)是較為常用的線性相關(guān)性分析方法，其主要反映兩個變量的線性相關(guān)程度。通過對目標(biāo)腦區(qū)的腦電信號進(jìn)行加窗截斷，可以獲取在體多通道電生理記錄技術(shù)電極間的動態(tài)功能連接關(guān)系。

本文以rTMS、cTBS及iTBS三種刺激模式的大鼠實驗?zāi)Ｐ团c無刺激對照組大鼠模型為研究對象，結(jié)合在體多通道電生理記錄技術(shù)與T迷宮工作記憶行為學(xué)任務(wù)實驗，從局部腦功能網(wǎng)絡(luò)的角度入手，基于LFPs信號數(shù)據(jù)構(gòu)建腦功能網(wǎng)絡(luò)，探究不同模式TMS對WM影響的差異，以促進(jìn)TMS刺激模式的優(yōu)化，為TMS在臨床應(yīng)用及腦認(rèn)知功能領(lǐng)域的研究提供參考。

1 材料與方法

本文以成年雄性Wistar大鼠為實驗對象，首先制備三種磁刺激模式下的模型鼠，之后對大鼠實施在體多通道微電極植入手術(shù)，最后進(jìn)行T迷宮工作記憶行為學(xué)任務(wù)實驗，同時記錄實驗過程中大鼠的腦電數(shù)據(jù)。實驗整體時間進(jìn)度如圖1所示。實驗結(jié)束后統(tǒng)計大鼠的行為學(xué)參數(shù)，基于皮爾森相關(guān)系數(shù)構(gòu)建LFPs網(wǎng)絡(luò)并分析其網(wǎng)絡(luò)連接特性。

圖1 實驗整體時間進(jìn)度 Fig.1 The arrangement of experimental schedule

1.1 動物實驗?zāi)Ｐ?/h3>

本文以8～9周齡體重約300g的成年雄性Wistar大鼠作為實驗?zāi)Ｐ?。將實驗?zāi)Ｐ褪箅S機分為四組，分別記為control組（空白組）、rTMS組（重復(fù)組）、cTBS組（連續(xù)組）及iTBS組（間斷組），每組6只。本實驗所有程序均已由河北工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（審查編號：HEBUTaCUC201905）。

1.2 實驗?zāi)Ｐ椭苽?/h3>

除control組外，其余三組實驗大鼠均需接受磁刺激。磁刺激設(shè)備采用英國Magstim公司生產(chǎn)的Rapid2重復(fù)經(jīng)顱磁刺激系統(tǒng)，其刺激頻率范圍為0～100Hz，刺激強度最大值為2.2T，刺激時間連續(xù)可調(diào)節(jié)，刺激線圈采用8字型線圈。對大鼠進(jìn)行磁刺激前需先確定刺激強度，為此，需先測量大鼠的運動閾值，得到測量結(jié)果的平均值作為磁刺激強度（22%最大機器輸出）。rTMS組使用5Hz的刺激頻率對大鼠頭部前額葉區(qū)域進(jìn)行120s的rTMS刺激，cTBS組進(jìn)行40s的cTBS刺激，iTBS組進(jìn)行200s的iTBS刺激，保證每只大鼠均接受600個刺激脈沖。三種磁刺激模式示意圖如圖2所示。

圖2 三種模式刺激示意圖 Fig.2 Three patterns of transcranial magnetic stimulation

每只大鼠每天刺激一次，每次600個脈沖，刺激持續(xù)14天，期間對control組進(jìn)行除刺激外的全部相同操作。

1.3 在體多通道微電極植入手術(shù)

為采集大鼠在進(jìn)行T迷宮任務(wù)過程中的腦電信號，需對大鼠實施在體多通道微電極植入手術(shù)，手術(shù)開始前24h對大鼠進(jìn)行禁食但保證其飲水。在體多通道微電極植入手術(shù)準(zhǔn)備工作包括向模型鼠的腹腔注射水合氯醛（40mg/kg）以對大鼠進(jìn)行麻醉，再進(jìn)行皮下注射阿托品以減少大鼠的呼吸道分泌。待模型鼠完全麻醉后，將大鼠的頭部毛發(fā)剔除并將大鼠頭部固定到立體定位儀上。完成準(zhǔn)備工作后正式開始在體多通道微電極植入手術(shù)：切開模型鼠頭皮，使其顱骨暴露以找出冠狀縫與矢狀縫的交點，參考大鼠腦部立體定位圖譜，找出PFC區(qū)域并與此交點的相對位置，以該點為原點，使用顱鉆在顱骨上向前后取2.5～4.5mm、左右0.2～1mm開矩形窗，直至硬腦膜暴露。將硬腦膜挑除后，將16（2×8）通道微電極陣列垂直推進(jìn)至PFC腦區(qū)內(nèi)，與此同時，對神經(jīng)元的電活動信號進(jìn)行實時監(jiān)測。電極陣列達(dá)到正確深度且電極檢測所得信號穩(wěn)定則認(rèn)為電極植入成功，用生理鹽水對創(chuàng)口進(jìn)行清理后使用瓊脂覆蓋創(chuàng)口。待瓊脂完全固化后，使用牙科水泥將電極陣列固定在顱骨上，最后對創(chuàng)口進(jìn)行消毒防止感染，在體多通道微電極植入手術(shù)完成。

在體多通道微電極植入術(shù)后，令大鼠靜養(yǎng)恢復(fù)約48h，保證其飲食，期間觀察大鼠的恢復(fù)情況，直至大鼠恢復(fù)至精神狀態(tài)良好。

1.4 工作記憶行為學(xué)T迷宮實驗

大鼠恢復(fù)完成后進(jìn)行為期兩天的T迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練。大鼠可以在T迷宮中進(jìn)行自由探索，每天訓(xùn)練兩次，每次30min。

訓(xùn)練完成后正式開始T迷宮實驗。每天每只大鼠進(jìn)行兩組T迷宮WM任務(wù)實驗，每組包含20次實驗，所有實驗均需在安靜環(huán)境下進(jìn)行。單次實驗包括自由選擇及延時交替選擇兩個部分：實驗開始前，在T迷宮的左右兩個臂端放置食物獎勵，大鼠被擋板隔離在起始點區(qū)域；實驗開始時撤離擋板，大鼠從起始點出發(fā)到達(dá)參考點后開始進(jìn)行自由選擇，選擇完成后大鼠即會進(jìn)入一個臂端，在大鼠得到食物獎勵時另一側(cè)臂端被擋板擋住，大鼠取食結(jié)束后回到起始點并用擋板隔離，經(jīng)過5s的延遲后撤離擋板重新出發(fā)，延時交替選擇階段開始。此時將會出現(xiàn)兩種情況：大鼠延時交替選擇與自由選擇均選擇了同一側(cè)臂端記為一次錯誤執(zhí)行WM任務(wù)，大鼠延時交替選擇與自由選擇均選擇了不同側(cè)臂端，記為一次正確執(zhí)行了WM任務(wù)。T迷宮示意圖如圖3所示，圖3a中，大鼠自由選擇了左側(cè)臂端，則延時交替時若選擇左端記為錯誤，選擇右端記為正確，圖3b中，大鼠自由選擇了右側(cè)臂端，則延時交替時若選擇右端記為錯誤，選擇左端記為正確。

圖3 T迷宮 Fig.3 T-maze

一次實驗完成后大鼠需回到起始點準(zhǔn)備下一次WM任務(wù)。大鼠執(zhí)行任務(wù)過程中需記錄其行為學(xué)數(shù)據(jù)、LFPs信號以及大鼠每次實驗經(jīng)過參考點的時刻。當(dāng)大鼠完成T迷宮實驗的正確率連續(xù)兩天大于或等于80%，即認(rèn)為大鼠學(xué)會了此項任務(wù)。

1.5 數(shù)據(jù)采集

本文應(yīng)用美國Plexon公司生產(chǎn)的OmniPlex128通道神經(jīng)電生理信號采集系統(tǒng)對四組大鼠PFC區(qū)域的神經(jīng)電活動信號進(jìn)行記錄，采樣頻率為1kHz。在大鼠進(jìn)行T迷宮實驗時同步采集腦電信號，共得到四組大鼠在執(zhí)行WM任務(wù)實驗時的16通道原始腦電信號數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

1.6.1 行為學(xué)數(shù)據(jù)

記錄大鼠每日各次實驗正確率情況。迷宮實驗完成后統(tǒng)計四組大鼠達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)的平均天數(shù)。

1.6.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對在體多通道記錄技術(shù)所得到的原始腦電信號數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理以得到LFPs數(shù)據(jù)。首先采用50Hz陷波器去除工頻干擾，之后應(yīng)用0～100Hz低通濾波器獲取包含θ 及γ 頻段的LFPs數(shù)據(jù)。

1.6.3 LFPs網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

得到0～100Hz的16通道LFPs信號后，應(yīng)用基 于皮爾森相關(guān)系數(shù)rij的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法，對四組大鼠在進(jìn)行WM任務(wù)實驗過程中延時交替階段的LFPs 信號進(jìn)行分析，基于各個通道LFPs之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)值構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)矩陣探究刺激組大鼠與對照組大鼠PFC的LFPs相關(guān)網(wǎng)絡(luò)特征模式，其中，皮爾森相關(guān)系數(shù)為

式中，t為時間；T為時間序列總長度；xi、xj為通道節(jié)點i與j的時間序列；分別為通道 節(jié)點i與j的時間序列平均值。最終可得到一個 16×16的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)矩陣。

1.6.4 基于皮爾森相關(guān)的LFPs網(wǎng)絡(luò)連接特性分析

本文選取基于圖論的網(wǎng)絡(luò)連接密度D以及全 局效率Eg來進(jìn)一步分析四組大鼠在執(zhí)行WM任務(wù)過程中LFPs信號網(wǎng)絡(luò)的連接特性。

首先需引入最短路徑長度Lij的概念：網(wǎng)絡(luò)中兩個節(jié)點的最短路徑長度指連接兩個節(jié)點的最少邊 數(shù)。進(jìn)一步計算網(wǎng)絡(luò)連接密度及全局效率，網(wǎng)絡(luò)連接密度表征網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點之間連接的緊密程度，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點之間的連接數(shù)目越多，強度越大，則網(wǎng)絡(luò)連接密度越大[27]。網(wǎng)絡(luò)連接密度的定義為

式中，N為通道個數(shù)；K為網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點間的實際最短路徑個數(shù)。連接密度的取值范圍在0～1之間。當(dāng)網(wǎng)絡(luò)的連接狀態(tài)到達(dá)理想狀態(tài)時，即網(wǎng)絡(luò)中的每個節(jié)點與其他節(jié)點之間均存在最短路徑時，網(wǎng)絡(luò)連接密度取得最大值1。

全局效率指網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點間實際存在的最短路徑長度的調(diào)和平均數(shù)的倒數(shù)，它是衡量網(wǎng)絡(luò)對信息總體傳輸能力的指標(biāo)[28]，全局效率越高網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點傳遞信息的速率則越快。全局效率的定義為

式中，n為節(jié)點數(shù)；ijL為節(jié)點i與節(jié)點j之間的最短路徑長度；gE的取值范圍為[0, 1][29-30]。

1.6.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析與t檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P值為參考對組間數(shù)據(jù)有無統(tǒng)計學(xué)意義進(jìn)行判斷，認(rèn)為當(dāng)P≥0.05時數(shù)據(jù)無顯著性差異，當(dāng)P＜0.05時數(shù)據(jù)具有顯著性差異并記為“*”。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)統(tǒng)計分析

每組大鼠每天執(zhí)行WM任務(wù)的平均正確率能夠反映出大鼠在整個實驗過程中整體任務(wù)完成情況，四組大鼠每天平均正確率如圖4所示。

圖4 四組大鼠每天平均正確率 Fig.4 Average daily correct rate of rats in each group

圖4中橫坐標(biāo)表示實驗天數(shù)，縱坐標(biāo)表示正確率，結(jié)果表明，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，大鼠執(zhí)行任務(wù)的正確率均呈現(xiàn)上升趨勢，各組別大鼠在經(jīng)過一定天數(shù)的訓(xùn)練后均能夠達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)。此外，從圖中可看出，在實驗初期階段（第1～5天）刺激組大鼠的正確率均高于空白對照組，說明不同刺激模式作用對大鼠的認(rèn)知行為產(chǎn)生了一定的影響。

達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)所用天數(shù)反映了各組大鼠學(xué)習(xí)T迷宮WM任務(wù)規(guī)則的速率，是本文中評價磁刺激對四組大鼠WM能力影響的重要指標(biāo)，統(tǒng)計四組大鼠達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)的平均天數(shù)，如圖5所示。圖中采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示數(shù)據(jù)，四組大鼠達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)的平均天數(shù)為：control組（9.75±1.875）天，rTMS組（5.25±2.276）天，cTBS組（6.17±1.863）天，iTBS組（4.25±1.920）天；經(jīng)過單因素方差分析，結(jié)果表明，三種刺激模式造成各組大鼠間達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)天數(shù)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），認(rèn)為刺激組均先于空白對照組達(dá)到了“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)，且iTBS平均4.25天達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)，遠(yuǎn)早于cTBS平均6.17天達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)（P＜0.05），說明本文所選用的三種TMS模式均能改善大鼠的工作記憶行為學(xué)表現(xiàn)；且刺激組中iTBS達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)所用時間最短，rTMS組所 用時間次之，cTBS組在刺激組中達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)所用時間最長，說明iTBS能夠顯著改善工作記憶功能。

圖5 四組大鼠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)平均天數(shù) Fig.5 The average days of reaching the standard in four groups

2.2 基于皮爾森相關(guān)系數(shù)的LFPs網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)關(guān)系

對T迷宮任務(wù)中大鼠位于參考點前后各2 000ms（共4 000ms）時間段內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。利用皮爾森相關(guān)系數(shù)公式，得到四組不同模式磁刺激大鼠的16×16的關(guān)聯(lián)矩陣，如圖6所示。

圖6 四組大鼠通道間關(guān)聯(lián)矩陣 Fig.6 The correlation matrix between channels of four groups of rats

圖6中，圖6a～圖6d分別表示空白組、重復(fù)組、連續(xù)組以及間斷組執(zhí)行WM任務(wù)過程中通道間關(guān)聯(lián)值矩陣，矩陣的橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)均表示在體多通道電極編號，矩陣中的每個元素對應(yīng)從橫軸對應(yīng)通道到縱軸對應(yīng)通道的皮爾森相關(guān)系數(shù)，相關(guān)值以顏色進(jìn)行標(biāo)識，顏色由白至黑代表相關(guān)值從0～1增大，每個矩陣均關(guān)于對角線呈對稱分布，矩陣中的對角線表示通道自身與自身的相關(guān)值，均將其設(shè)置為1?？梢钥闯?，相鄰的電極對的相關(guān)性較高，空間距離越遠(yuǎn)，相關(guān)性的差值越明顯，表明大鼠在進(jìn)行選擇時前額葉皮層相鄰的神經(jīng)元集群之間的關(guān)聯(lián)性顯著增大。

圖7為閾值為0.7時四組不同模式刺激下大鼠的16×16鄰接二值矩陣。

圖7 四組大鼠通道間鄰接二值矩陣 Fig.7 Adjacency binary matrices of four groups of rats

圖7顯示，當(dāng)通道間的相關(guān)系數(shù)小于閾值時，鄰接矩陣中對應(yīng)的位置取0，表示兩通道之間沒有連接，而當(dāng)通道之間的相關(guān)系數(shù)大于或等于閾值時，鄰接矩陣中對應(yīng)的位置取1，表示兩個通道之間存在連接。圖7a～圖7d分別表示空白組、重復(fù)組、連續(xù)組以及間斷組可以看出，在閾值0.7下磁刺激組鄰接矩陣中1的數(shù)量高于空白對照組，且刺激組5～7通道中1的數(shù)量顯著高于空白對照組，在cTBS組中5～16通道的連接較多，而在iTBS組中1～10通道的連接較多，這可能是由于不同的TBS對神經(jīng)元集群的作用效果不同而導(dǎo)致的；同時，相隔較遠(yuǎn)的通道依然保持較低水平的相關(guān)性，與上述結(jié)果具有一致性。

圖8為四組大鼠在執(zhí)行WM任務(wù)期間的皮爾森相關(guān)系數(shù)平均值。圖中，橫坐標(biāo)表示不同組別，縱坐標(biāo)表示各個模式大鼠執(zhí)行WM任務(wù)過程中的平均相關(guān)值大小，采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示數(shù)據(jù)，四組大鼠平均相關(guān)值為：空白組（0.469±0.039），重復(fù)組（0.547±0.014），連續(xù)組（0.578±0.013），間斷組（0.656±0.014）；經(jīng)過單因素方差分析，表明 刺激造成的各組大鼠間平均相關(guān)值的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；圖中結(jié)果表明，刺激組大鼠的平均相關(guān)值均高于空白對照組（P＜0.05），且iTBS組平均相關(guān)值達(dá)到0.65，顯著高于其他兩個刺激組（P＜0.05），說明磁刺激能夠在一定程度上改善WM任務(wù)中LFPs信號間的相關(guān)性，其中，iTBS的改善效果最為顯著（P＜0.05），此結(jié)果與前述行為學(xué)結(jié)果及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系結(jié)果具有一致性。

圖8 四組大鼠平均相關(guān)值 Fig.8 The average of the correlation coefficients of the four groups

2.3 LFPs網(wǎng)絡(luò)連接特性

為進(jìn)一步對各組大鼠LFPs網(wǎng)絡(luò)連接特性進(jìn)行分析，引入網(wǎng)絡(luò)連接密度及全局效率。四組大鼠的網(wǎng)絡(luò)連接密度如圖9所示。

圖9 四組大鼠的網(wǎng)絡(luò)連接密度 Fig.9 Network connection density of four groups

圖9給出了四組大鼠LFPs網(wǎng)絡(luò)連接密度結(jié)果，其中，空白組（0.433±0.071），重復(fù)組（0.5±0.095），連續(xù)組（0.517±0.088）以及間斷組（0.483±0.058）；可以看出，四組大鼠中刺激組的網(wǎng)絡(luò)連接密度比空白對照組高（P＜0.05），且刺激組中呈現(xiàn)cTBS的網(wǎng)絡(luò)連接密度高于iTBS組、iTBS的網(wǎng)絡(luò)連接密度高于rTMS組（P＜0.05），說明磁刺激使得腦功能網(wǎng)絡(luò)各個節(jié)點的緊密化程度得到提高，且cTBS可以使網(wǎng)絡(luò)的連接密度顯著增大。

四組大鼠的LFPs網(wǎng)絡(luò)全局效率如圖10所示。圖10中給出了四組大鼠LFPs網(wǎng)絡(luò)全局效率結(jié)果，其中，空白組（0.528±0.085），重復(fù)組（0.554±0.094），連續(xù)組（0.618±0.046）以及間斷組（0.688±0.076）；結(jié)果表明，刺激組大鼠的網(wǎng)絡(luò)全局效率均高于空白對照組（P＜0.05），且iTBS組的全局效率最大（P＜0.05），說明刺激組大鼠在WM任務(wù)的延時交替選擇中LFPs網(wǎng)絡(luò)的信息總體傳輸能力高于空白對照組，其中，iTBS對網(wǎng)絡(luò)信息傳輸速率的改善最為明顯，此結(jié)果與皮爾森相關(guān)系數(shù)平均值等結(jié)果具有一致性。

圖10 四組大鼠的LFPs網(wǎng)絡(luò)全局效率 Fig.10 The global efficiency of LFPs networks of four groups

2.4 LFPs相關(guān)值的動態(tài)變化

對T迷宮WM任務(wù)中大鼠位于參考點前后各2 000ms（共4 000ms）時間段內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，使用200ms矩形窗進(jìn)行加窗節(jié)段將數(shù)據(jù)分為不重疊的片段，計算每個片段中每兩個通道之間的相關(guān)值作為片段中心時刻的各通道對之間的相關(guān)性結(jié)果，按照相關(guān)值隨時間動態(tài)變化進(jìn)行分析，四組大鼠相關(guān)系數(shù)隨時間變化曲線如圖11所示。圖中，帶狀陰影表示標(biāo)準(zhǔn)差。由圖中可以看出，各模式相關(guān)值在行為學(xué)參考點前1 500ms到前500ms間明顯高于其他位置，相關(guān)值峰值在位于約參考點前1 000ms處出現(xiàn)，且四組大鼠的相關(guān)值變化趨勢基本一致，整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；且刺激組 相關(guān)值均高于空白對照組相關(guān)值，cTBS與iTBS組大鼠進(jìn)行選擇行為時PFC的LFPs網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性峰值結(jié)果明顯高于rTMS組及control組，其中，iTBS組峰值高于cTBS組，rTMS組峰值高于control組；且iTBS組峰值出現(xiàn)時間約為參考點前700ms，相較于其他組別峰值出現(xiàn)在參考點前約1 000ms更為接近參考點，可見，iTBS刺激可以使?jié)摲诳s短，說明iTBS能夠使大鼠在更短的時間內(nèi)做出正確的選擇。

圖11 四組大鼠相關(guān)系數(shù)隨時間變化曲線 Fig.11 The curves of correlation coefficient of four groups

2.5 行為學(xué)任務(wù)正確率與相關(guān)值的關(guān)系

為進(jìn)一步確定磁刺激對大鼠工作記憶的影響，按照相關(guān)值對應(yīng)WM行為學(xué)任務(wù)正確率進(jìn)行分析，四組大鼠相關(guān)值隨正確率變化散點如圖12所示。

圖12 四組大鼠相關(guān)值隨正確率變化散點 Fig.12 Scatter plot of correlation value with accuracy of four groups

圖12可以看出，正確率與相關(guān)值呈正相關(guān)且二者呈線性變化趨勢，經(jīng)過擬合后整體上各組的相關(guān)值均隨正確率的增加而增加，這一關(guān)系結(jié)果表明，前額葉皮層的神經(jīng)元集群的協(xié)同相關(guān)作用參與了WM任務(wù)學(xué)習(xí)過程，相關(guān)值隨著訓(xùn)練正確率的增加而增加，說明經(jīng)過訓(xùn)練后認(rèn)知神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)間的協(xié)同性增強。

3 討論

本文基于皮爾森相關(guān)系數(shù)對不同模式下經(jīng)顱磁刺激后大鼠執(zhí)行WM任務(wù)中的LFPs信號進(jìn)行分析，基于皮爾森相關(guān)系數(shù)構(gòu)建了LFPs連接網(wǎng)絡(luò)并引入網(wǎng)絡(luò)連接特性參數(shù)：網(wǎng)絡(luò)連接密度及全局效率。通過對比各組大鼠在T迷宮內(nèi)執(zhí)行WM任務(wù)延時交替過程中的行為學(xué)表現(xiàn)及LFPs神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的差異討論不同模式經(jīng)顱磁刺激技術(shù)對WM相關(guān)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)特性的影響。

行為學(xué)結(jié)果表明，經(jīng)過TMS的正常成年大鼠比無任何刺激的正常成年大鼠達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)的天數(shù)顯著縮短（P＜0.05），不同模式的經(jīng)顱磁刺激對大鼠的認(rèn)知行為產(chǎn)生了相應(yīng)的影響。達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)的平均天數(shù)能夠反映出各組大鼠學(xué)習(xí)WM任務(wù)實驗規(guī)則的速度，是評價大鼠的工作記憶行為學(xué)能力的關(guān)鍵指標(biāo)之一，由結(jié)果可以看出，刺激組模型大鼠的學(xué)會天數(shù)均低于空白對照組，且iTBS組較其他刺激組所需時間最短。W. C. Sung等[31]的研究說明，經(jīng)過iTBS后與工作記憶相關(guān)的神經(jīng)生理學(xué)變化更為顯著，與上述結(jié)果具有一致性。本文選取的三種不同模式下的TMS均能夠在一定程度上改善大鼠在執(zhí)行工作記憶任務(wù)過程中的表現(xiàn)，其中，iTBS的效果最為明顯。有研究證實，磁刺激能夠增強嚙齒類動物的空間學(xué)習(xí)能力[32-33]，王玲[34]等的研究也通過水迷宮證實了上述結(jié)論，因此，本文結(jié)果可以為TMS能夠正向影響WM能力并改善認(rèn)知功能提供依據(jù)。

相關(guān)性能夠反映神經(jīng)元信號之間的關(guān)聯(lián)特性，本文進(jìn)一步對包含θ 及γ 的0～100Hz頻段LFPs信號進(jìn)行相關(guān)性分析。LFPs信號能夠反映神經(jīng)元集群的放電情況[35]，大鼠在學(xué)會某項任務(wù)前后的神經(jīng)元放電情況具有差異性[36]，從相關(guān)性分析的結(jié)果可以看出，相鄰電極間的相關(guān)值一般大于相隔較遠(yuǎn)的兩電極間的相關(guān)值，電極對之間的相關(guān)性一般隨著空間距離增大而減小。觀察四組大鼠執(zhí)行WM任務(wù)過程中相關(guān)值隨時間變化曲線發(fā)現(xiàn)，大鼠在WM任務(wù)的延時交替階段，LFPs網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)值在行為學(xué)參考點前逐漸升高，并在經(jīng)過參考點前約1 000ms達(dá)到峰值，四組大鼠相關(guān)值隨時間變化的趨勢基本一致，且相關(guān)值呈現(xiàn)刺激組大于空白對照組，且θ 節(jié)律刺激大于rTMS組；圖10中顯示，cTBS組大鼠及iTBS組大鼠在進(jìn)行工作記憶選擇行為前的前額葉皮層LFPs相關(guān)值起始值與峰值均高于rTMS組及control組，說明TBS能夠明顯改善大鼠在WM任務(wù)期間的LFPs網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)性。通過計算四組大鼠的平均相關(guān)值，發(fā)現(xiàn)刺激組的相關(guān)值均顯著高于空白對照組，且iTBS組的相關(guān)值達(dá)到最大。四組大鼠平均相關(guān)值表明三種磁刺激均正向影響了大鼠在WM任務(wù)中延時交替階段前額葉皮層神經(jīng)元間協(xié)同性，其中，iTBS的影響最為明顯。腦認(rèn)知功能的正確執(zhí)行需各神經(jīng)元集群協(xié)同完成，LFPs網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性反映了前額葉皮層神經(jīng)元之間的協(xié)同關(guān)聯(lián)性，本文還計算了LFPs的網(wǎng)絡(luò)連接密度及全局效率以探究磁刺激對網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的緊密程度以及網(wǎng)絡(luò)的信息傳遞速率的影響。

對基于皮爾森相關(guān)系數(shù)LFPs網(wǎng)絡(luò)的連接密度及全局效率進(jìn)行分析，可以看出，刺激組大鼠的網(wǎng)絡(luò)連接密度均高于空白對照組，說明磁刺激使得腦功能網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的緊密程度得到增強。進(jìn)一步對網(wǎng)絡(luò)的全局效率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)刺激組大鼠的網(wǎng)絡(luò)全局效率值均高于空白對照組，經(jīng)過磁刺激后大鼠的LFPs網(wǎng)絡(luò)全局效率明顯升高，其中，iTBS組的全局效率最高，說明磁刺激能使網(wǎng)絡(luò)中信息的傳遞速率加快且iTBS對網(wǎng)絡(luò)中信息傳輸速率的影響最為明顯。

正確率與相關(guān)性的關(guān)系結(jié)果表明，當(dāng)行為學(xué)任務(wù)正確率逐步升高的同時，對應(yīng)的LFPs相關(guān)值也相應(yīng)增大，相關(guān)值與正確率呈正相關(guān)，表明神經(jīng)元集群間的協(xié)同效應(yīng)在WM行為學(xué)任務(wù)的表現(xiàn)中具有重要的影響作用，這可能是WM的潛在編碼機制；本結(jié)果說明磁刺激能夠有效提高WM過程中神經(jīng)元集群間的相關(guān)協(xié)同作用，進(jìn)而指導(dǎo)或影響動物的行為。同理，各組的正確率越高，相關(guān)值越大，即更高的任務(wù)執(zhí)行準(zhǔn)確性及更好的任務(wù)表現(xiàn)得益于更緊密的認(rèn)知神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同調(diào)制。相關(guān)值反映了WM過程中網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)電活動表現(xiàn)，LFPs網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)協(xié)同貫穿于整個WM任務(wù)過程中，幫助大腦做出正確的行為決策和選擇。

文中實驗分別應(yīng)用rTMS、cTBS以及iTBS三種經(jīng)顱磁刺激模式對大鼠的前額葉皮層進(jìn)行刺激，結(jié)果表明，經(jīng)過磁刺激后大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)均得到了不同程度的改善，其中，TBS的作用效果好于rTMS，其原因在于TBS是模擬了神經(jīng)元動作電位放電過程的新興經(jīng)顱磁刺激模式，與標(biāo)準(zhǔn)的rTMS相比，TBS能以更高的效率對神經(jīng)元集群間的協(xié)同作用產(chǎn)生較為持續(xù)的刺激效果[10]，且TBS已被證實對神經(jīng)可塑性有正向的影響作用[37]，P. Vignaud等[38]研究表明，TBS能夠增強工作記憶相關(guān)腦區(qū)的動態(tài)功能連通性，印證了TBS能夠?qū)ぷ饔洃涍M(jìn)行有效改善。在TBS中iTBS對行為學(xué)的改善效果好于cTBS，其機理可能在于iTBS能夠更有效地引起神經(jīng)元皮質(zhì)興奮，提高神經(jīng)可塑性。Zhang Guoqin等[39]研究表明，iTBS能使健康被試的運動誘發(fā)電位顯著增大而cTBS后被試的運動誘發(fā)電位無顯著變化，說明cTBS引起神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)的效率低于iTBS；X. H. Ruan等[40]研究證實了cTBS對初級感覺運動皮質(zhì)的區(qū)域同質(zhì)性沒有顯著影響，而iTBS促進(jìn)了雙側(cè)感覺運動皮質(zhì)區(qū)域同質(zhì)性的提高，與本文中iTBS的刺激效果好于cTBS的結(jié)果具有一致性。

本文通過探索WM任務(wù)過程中不同模式磁刺激后大鼠LFPs相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)及其網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的差異，探究三種不同模式的經(jīng)顱磁刺激對大鼠工作記憶神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的影響機制研究，研究結(jié)果表明，iTBS、cTBS及rTMS均能促進(jìn)腦網(wǎng)絡(luò)的關(guān)聯(lián)性，其中，iTBS在提高正常大鼠工作記憶能力、改善大鼠認(rèn)知功能方面有較為明顯的改善作用。已有相關(guān)研究將iTBS應(yīng)用于精神分裂癥[41]及抑郁癥[42]并已驗證了其安全性與有效性。本文的研究結(jié)果可以為TMS在臨床應(yīng)用及腦認(rèn)知功能領(lǐng)域的研究提供參考。

4 結(jié)論

本文對施加不同模式經(jīng)顱磁刺激后的大鼠實施在體多通道電極植入手術(shù)，采集其執(zhí)行工作記憶行為學(xué)T迷宮任務(wù)的腦電信號，應(yīng)用皮爾森相關(guān)系數(shù)原理對所得腦電信號進(jìn)行處理，構(gòu)建了LFPs腦功能網(wǎng)絡(luò)并對其網(wǎng)絡(luò)連接密度及全局效率進(jìn)行分析。行為學(xué)結(jié)果表明，rTMS、cTBS及iTBS對工作記憶任務(wù)的學(xué)習(xí)效率均具有促進(jìn)作用，刺激組大鼠達(dá)到“學(xué)會”標(biāo)準(zhǔn)的天數(shù)明顯小于對照組，且iTBS的促進(jìn)效果最為顯著。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，經(jīng)過iTBS及cTBS刺激后的大鼠在參考點前的相關(guān)系數(shù)顯著大于rTMS組與空白對照組。通過分析LFPs網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過磁刺激的三組大鼠的網(wǎng)絡(luò)連接密度更高，即磁刺激加強了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點之間的緊密程度；磁刺激組的網(wǎng)絡(luò)全局效率均高于空白對照組，且iTBS的全局效率最高，說明iTBS顯著提高了網(wǎng)絡(luò)中的信息傳輸速率。綜上所述，iTBS、cTBS及rTMS均能在一定程度上促進(jìn)腦網(wǎng)絡(luò)的關(guān)聯(lián)性，提高正常大鼠的工作記憶能力。其中，iTBS相對其他兩個刺激組顯示更好的效果。