宋志強(qiáng)，張旭君，康李鵬，王立超，周立峰，陳鳳毛

(1.淳安縣林業(yè)局，浙江淳安 311799；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京 210037)

擬松材線蟲Bursaphelenchus mucronatus是松屬Pinus植物的寄生性線蟲，廣泛分布于歐亞大陸[1]。作為松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus的姊妹種，兩者之間的親緣關(guān)系極為接近，個(gè)體形態(tài)和生物學(xué)特性極為相似，占據(jù)著相同的生態(tài)位，并擁有相同的媒介昆蟲和寄主類群[2]；兩者能夠雜交，產(chǎn)生可育雜交后代，但后代的繁殖能力相對較弱[3－4]。另外，一些擬松材線蟲的蟲株對松樹也具有較強(qiáng)的致病性[5－7]。因此，擬松材線蟲是公認(rèn)的松材線蟲病病原鑒定最為主要的干擾物種，如何區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲成為限制松材線蟲病病原鑒定準(zhǔn)確率的主要因素。

當(dāng)前，國內(nèi)外對于松材線蟲病病原鑒定大多采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)。形態(tài)學(xué)鑒定主要根據(jù)雌性成蟲的尾尖突長短來區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲[8－9]，但由于個(gè)體之間存在一定的差異，往往導(dǎo)致沒有豐富種類鑒定經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員難以準(zhǔn)確識別[10]。另外，由于取樣量和取樣季節(jié)等因素的影響，從松木樣品中分離出來的線蟲數(shù)量過少或找不到雌性成蟲等情況時(shí)有發(fā)生，妨礙了形態(tài)學(xué)鑒定。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子技術(shù)已經(jīng)成為松材線蟲物種鑒定的常用輔助手段之一，但由于松材線蟲和擬松材線蟲的親緣關(guān)系十分接近，假陽性現(xiàn)象偶有發(fā)生，錯誤地將擬松材線蟲鑒定為松材線蟲。因此，在研究松材線蟲分子檢測與鑒定技術(shù)的同時(shí)，開發(fā)擬松材線蟲分子鑒定技術(shù)，構(gòu)建可疑線蟲雙重檢測的分子鑒定技術(shù)體系，對于提高松材線蟲種類鑒定準(zhǔn)確性具有十分重要的意義，同時(shí)也能夠?yàn)閿M松材線蟲本身的系統(tǒng)發(fā)育等基礎(chǔ)生物學(xué)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲 供試的30株擬松材線蟲和10株松材線蟲均由南京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)研究所提供，其寄主和來源詳見表1。將各線蟲株系轉(zhuǎn)接到長滿灰葡萄孢Botrytis cinerea的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5～7 d，待灰葡萄孢菌絲被取食殆盡時(shí)，采用貝爾曼漏斗法收集線蟲[11]，備用。將收集到的線蟲移至無菌水的平皿中，靜置10 min后，棄上清，卵因?yàn)橛姓承粤粼谄矫蟮牡撞?。在顯微鏡下觀察，用移液槍吸取獲得單個(gè)卵或單條線蟲。

表1 供試線蟲的寄主及來源Tab.1 Geographic origins and host species of the nematode isolates

1.2 DNA提取 線蟲樣品用無菌水洗滌3～5次后，分別取40 μL(約1 000條)置于Eppendorf管中，加入 40 μL 線蟲裂解液(125 mmol/L KCl，25 mmol/L Tris－HCl，pH 8.3，3.75 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L DTT，1.125%Tween20，0.025% gelatine)，加入 2 μL 蛋白酶 K(200 mg/mL)，混勻，在65℃水浴中保持45 min，后95℃ 15 min；12 000 r/min離心3 min，取上清液；用 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Nanochip測定 DNA的濃度，－20℃?zhèn)溆谩τ趩螚l線蟲及單卵則采用10 μL體系的凍融法提取DNA[12]。

1.3 引物與TaqMan探針設(shè)計(jì) 從GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下載39種線蟲的核糖體DNA ITS。其中，傘滑刃屬Bursaphelenchus 36 種:B.mucronatus，B.xylophilus，B.hellenicus，B.rainulfi，B.thailandae，B.hofmanni，B.abietinus，B.anamurius，B.antoniae，B.arthuri，B.borealis，B.braaschae，B.clavicauda，B.conicaudatus，B.corneolus，B.eggersi，B.eremus，B.fungivorus，B.gerbera，B.hildegardae，B.hylobianum，B.okinawaensis，B.paracorneolus，B.paraparvispicularis，B.parathailandae，B.pinasteri，B.pinophilus，B.platzeri，B.poligraphi，B.seani，B.sexdentati，B.sinensis，B.tusciae，B.vallesianus，B.willibaldi，B.yongensis；長尾滑刃線蟲屬 Seinura 2種:S.lii和S.wuae；滑刃線蟲屬 Aphelenchoides 1種:A.macronucleatus。采用BioEid軟件(V7.2)對供試線蟲的核糖體DNA ITS進(jìn)行比對，在堿基差異較多的區(qū)域利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)擬松材線蟲的引物和TaqMan熒光探針。

1.4 TaqMan探針特異性檢測 驗(yàn)證擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針的特異性，對30株擬松材線蟲和10株松材線蟲分別進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR。實(shí)時(shí)熒光PCR儀為ABI SepOnePlus Real-Time PCR System 7500。 反應(yīng)總體積為10 μL，Premix Ex TaqTM(2 ×)5 μL，引物各0.25 μL，探針 0.5 μL，蒸餾水2.5 μL，DNA 模板1.5 μL。 反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 2 min；隨后95℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)；最后60℃ 20 s。

1.5 引物擴(kuò)增效率分析 分析擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增效率，將擬松材線蟲DNA進(jìn)行10倍法梯度稀釋5個(gè)濃度梯度后進(jìn)行 TaqMan實(shí)時(shí)熒光 PCR，反應(yīng)體系同1.4，獲得各梯度濃度的循環(huán)數(shù)值(threshold cycle values，Cq)。根據(jù)各梯度濃度及相應(yīng)的Cq值繪制擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程，并通過斜率法計(jì)算出引物的擴(kuò)增效率(Amplification efficiency，E)[13]。

1.6 探針靈敏度檢測 采用1.2方法所提取的單條線蟲和單個(gè)卵的DNA進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR，反應(yīng)體系同1.4，分析擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測擬松材線蟲的靈敏度。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)均設(shè)有3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并設(shè)有1個(gè)陰性對照。擴(kuò)增效率E＝(10－1/S－1) ×100%，S為擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。相關(guān)系數(shù)(R2)通過擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸計(jì)算獲得[12]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用Microsoft Excel 2007軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針設(shè)計(jì)從GeneBank上下載的39種滑刃屬、傘滑刃屬和長尾滑刃線蟲屬線蟲的核糖體DNA ITS，通過多重序列比對，發(fā)現(xiàn)在核糖體DNA ITS2存在較多的差異堿基(表2)。

表2 擬松材線蟲特異性TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR引物與探針設(shè)計(jì)Tab.2 Designing of special TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

2.2 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針驗(yàn)證對30株擬松材線蟲和10株松材線蟲分別進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果顯示，擬松材線蟲蟲株均檢測到了Cq值(20.2±0.7)，而松材線蟲蟲株均沒有檢測到Cq值，表明所設(shè)計(jì)的擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針具有特異性。

2.3 擬松材線蟲特異性引物擴(kuò)增效率 對擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物的擴(kuò)增效率曲線(圖1A)線性回歸分析，得到擴(kuò)增效率方程y＝－3.43x＋20.91(圖1B)，再根據(jù)斜率計(jì)算出擴(kuò)增效率E＝96%。擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物的擴(kuò)增效率為90%～105%，表明該引物能夠穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增基因序列。

圖1 擬松材線蟲特異性TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR引物擴(kuò)增效率分析Fig.1 Amplification efficiency of the TaqMan real-time PCR for B.mucronatus

2.4 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針靈敏度 所有參與TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)均得到了穩(wěn)定的Cq值(表3)，說明所設(shè)計(jì)的擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針具有較高的靈敏性。

表3 擬松材線蟲TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR引物與探針靈敏度分析Tab.3 Sensitivity of the TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

3 結(jié)論與討論

松材線蟲病是世界范圍內(nèi)有歷史記載以來最為嚴(yán)重的森林病害，對我國及多個(gè)國家的松林帶來巨大破壞，造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失。因此，松材線蟲被許多國家列為一級檢疫對象。借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，開發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高的分子檢測和鑒定技術(shù)成為近年來松材線蟲快速檢測技術(shù)研究的前沿和熱點(diǎn)[14]。然而，由于松材線蟲與擬松材線蟲的親緣關(guān)系過于接近，檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)一定的假陽性，造成鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究瞄準(zhǔn)松材線蟲種類鑒定的主要干擾物種擬松材線蟲，基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開發(fā)出一套可用于擬松材線蟲分子鑒定的特異性引物和探針，結(jié)合已有的松材線蟲分子檢測與鑒定技術(shù)，可以構(gòu)建起可疑線蟲雙重檢測分子鑒定技術(shù)體系，為進(jìn)一步開發(fā)實(shí)用有效的檢測新設(shè)備奠定基礎(chǔ)，在研究思路上具有一定的創(chuàng)新性。研究結(jié)果表明，該技術(shù)靈敏度高，可以實(shí)現(xiàn)對單條擬松材線蟲甚至單個(gè)卵的檢測和鑒定，對排除擬松材線蟲的干擾和提高松材線蟲種類鑒定的準(zhǔn)確性具有十分重要的意義。與此同時(shí)，本研究結(jié)果也能夠?yàn)樯钊腴_展擬松材線蟲本身的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化生物學(xué)等基礎(chǔ)理論研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，多種分子技術(shù)開始應(yīng)用于線蟲的檢測和鑒定。張立海和趙立榮等[15－16]以松材線蟲ITS1區(qū)域上的特異性引物5′－GATGATGCGATTGGTGACT－3′、擬松材線蟲ITS1區(qū)域上的特異性引物5′－TGCGCTGCGTTGAGTCGA－3′為正向引物，以5.8S區(qū)域上的松材線蟲和擬松材線蟲的通用引物5′－CAATTCACTGCGTTCTTC－3′為反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果松材線蟲擴(kuò)增的片段長度329 bp，擬松材線蟲擴(kuò)增的片段長度206 bp，而其他滑刃線蟲與真滑刃線蟲則無擴(kuò)增產(chǎn)物。陳鳳毛等[17]應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)篩選出OPC18、OPN18引物組合，在擬松材線蟲株系中擴(kuò)增出一條970 bp特異性片段，能準(zhǔn)確地鑒定擬松材線蟲。Urek等[18]認(rèn)為限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)可用于區(qū)分多種滑刃屬線蟲和傘滑刃屬線蟲；但陳鳳毛等[19]認(rèn)為RFLP會產(chǎn)生大量長度相近的酶切片段，導(dǎo)致這種技術(shù)不適合大量樣品的快速檢測和鑒定；而Filipiak等[20－21]進(jìn)一步證實(shí)基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可以用于區(qū)分松材線蟲與擬松材線蟲。另外，小亞基(Small subunit，SSU)[22]、大亞基(D2/D3 domain of large subunit，D2/D3 LSU)[23]和線粒體COI基因(Mitochondrial cytochrome oxidase I，mtCOI)[24]等均可被用于線蟲的種類鑒定。本研究基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，針對線蟲遺傳多變區(qū)核糖體DNA ITS設(shè)計(jì)擬松材線蟲特異性的引物和TaqMan探針組合，該組合經(jīng)驗(yàn)證具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榱謽I(yè)和海關(guān)檢疫提供有力的技術(shù)支撐。