韓雨庭，唐婕，尼瑪此姆，馬煥成，伍建榕，

(1.云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南昆明 650224；2.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224)

杉木Cunninghamia lanceolata是松柏目杉科杉木屬的一種重要的用材樹種[1]。杉木屬于常綠針葉喬木，因其生長速度快、主干通直、材質(zhì)輕柔細(xì)膩、木材便于加工等特點(diǎn)，在家具生產(chǎn)、船只建造和建筑等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2－3]。杉木是云南省文山州廣南縣重要的鄉(xiāng)土樹種之一，從20世紀(jì)70年代末開始被廣泛種植[4]。隨著廣南縣多措并舉開展實(shí)施林業(yè)工程項(xiàng)目，杉木已成為面積最大的用材樹種[5]。近幾十年，隨著杉木人工林面積的急劇擴(kuò)大，加之在同一林地上大面積集中連片栽種等，杉木人工林的弱點(diǎn)逐漸顯露，多種病害不時(shí)發(fā)生，猖獗危害[6]。

2019年廣南縣杉木幼林出現(xiàn)大范圍的黃化、枯死現(xiàn)象，對當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)造成了巨大影響。據(jù)調(diào)查，廣南縣3個(gè)人工杉木幼林病害癥狀均為針葉褪綠和枯死，病斑上可見大小不一的圓形或梭形小黑點(diǎn)，且病害輕重不一，可能為侵染性病害。為摸清杉木主要的侵染性病害種類和發(fā)病情況，減少侵染性病害對杉木生長和材積的危害，筆者對杉木人工林的侵染性病害發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，同時(shí)對病原菌進(jìn)行分離鑒定及致病性測定，以期為病害防治和培育抗病品種等工作提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 感病和健康杉木枝條采自廣南縣珠街鎮(zhèn)小魚溝村、竜達(dá)寨子和曙光鄉(xiāng)革洛村小組的杉木人工林。供試試劑Ezup柱式真菌基因組DNA抽提式試劑盒、引物ITS1和 ITS4均為生工生物公程(上海)股份有限公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

1.2 病原菌分離 選取感病的杉木針葉，采用常規(guī)的組織分離法[7]對病原菌進(jìn)行分離。將純化好的菌株接種于PDA斜面試管中，于4℃保存菌種。

1.3 病原菌形態(tài)鑒定 將獲得的代表性純化菌株移接至PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)，觀察并記錄菌落的形狀、色澤、生長速度等，在顯微鏡下觀察并記錄分生孢子的類型、形狀和大小等。選擇癥狀明顯的針葉材料，對病部用徒手切片法[8]切取針葉橫切片，在顯微鏡下觀察病原形態(tài)。

1.4 致病性測定 將純化后的病原真菌(KS－10、TJ－2)在 PDA平板上25℃培養(yǎng)7 d，用無菌水沖洗，配制成濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液。采用針刺接種法[9]，每個(gè)處理選取5段健康無病斑的杉木小枝，在每個(gè)小枝上選取10個(gè)針葉進(jìn)行接種。采用噴霧法將配制好的孢子懸浮液接種在健康杉木的針葉上，設(shè)2種病原菌單獨(dú)接種、先接種KS－10再接種TJ－2、先接種TJ－2再接種KS－10，共4個(gè)接種病原菌處理，對照處理用無菌水代替孢子懸浮液。待接種針葉上產(chǎn)生病斑后，對病斑進(jìn)行病原菌再分離和鑒定，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定 將純化后的單個(gè)菌落作為真菌 DNA提取的材料。利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒對代表菌株的DNA進(jìn)行提取。采用真菌通用引物 ITS1/ITS4對上述DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]，PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序。所得序列分別在GenBank數(shù)據(jù)庫中的 BLAST程序 (www http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)與庫中序列進(jìn)行比對，下載同源性較高的序列。通過 MEGA 6.0中的最大似然法(Maximum Likelihood，ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.6 病害發(fā)病程度調(diào)查 在廣南縣的杉木林中隨機(jī)選取150株，對3種侵染性病害進(jìn)行調(diào)查。依據(jù)表1中杉木侵染性病害的分級標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

表1 廣南縣杉木侵染性病害分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Disease grading standard of Chinese fir infectious diseases in Guangnan county

發(fā)病率(%)＝發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100

病情指數(shù)＝∑(各級病株數(shù)×該病級值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木炭疽病

菌落特征 分離物KS－10在PDA培養(yǎng)基上，菌落初期圓形，氣生菌絲白色，棉花狀，反面淺橘黃色；生長后期，以菌落中心為圓心，有淺橘色和黑色滲出物，為分生孢子液滴(圖1A)。

形態(tài)特征 該病原菌分生孢子盤散生，暫未發(fā)現(xiàn)剛毛；分生孢子梗光滑，無色，1～2個(gè)細(xì)胞(圖1B)；分生孢子透明，無隔膜，直，圓柱狀，兩端鈍圓，大小為(15.2～18.7)μm × (4.4～5.8)μm(圖1C)。

圖1 暹羅刺盤孢的菌落和分生孢子Fig.1 Colony and conidia of Colletotrichum siamense

分子生物學(xué)鑒定 構(gòu)建菌株KS－10的分子系統(tǒng)樹，如圖2所示。菌株 KS－10與參考菌株C.siamense(KP703372、 KP703373、 KP703390、LC208833、LC260488、LC260489、LC420017)位于同一分支，節(jié)點(diǎn)自展值為89，與其他近緣種保持較遠(yuǎn)的親緣距離。

圖2 基于ITS基因采用最大似然法構(gòu)建的杉木炭疽病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene of the pathogen of Chinese fir anthracnose by maximum likelihood method

鑒定結(jié)果 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定，確定杉木炭疽病的致病菌為暹羅刺盤孢C.siamense，屬于炭疽菌屬Colletotrichum，是子囊菌門Ascomycota糞殼菌綱Sordariomycetes小叢殼科Glomerellaceae小叢殼屬Glomerella的無性態(tài)。這是國內(nèi)外C.siamense在杉木上的首次報(bào)道。

致病性 接種病原菌KS－10孢子懸浮液5 d后，健康杉木的針葉出現(xiàn)黑褐色壞死斑(圖3A)，而對照組無明顯變化，未出現(xiàn)感病癥狀(圖3B)。對發(fā)病組織進(jìn)行病原物的再次分離，獲得的病原菌與接種的病原菌株KS－10相同，完成了柯赫氏法則的驗(yàn)證，證明菌株KS－10是杉木炭疽病的致病菌。

廣南縣杉木炭疽病梢枯型與葉枯型混雜，大面積發(fā)生。梢枯型多為梢頭10 cm以內(nèi)的嫩梢莖葉發(fā)病，病斑沒有明顯的界限，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)針葉紅褐色枯死。葉枯型多從針葉頂尖開始發(fā)病，產(chǎn)生較小壞死病斑，初期可見病健交界處明顯呈暗褐色，后期針葉枯死，呈灰白色(圖3C)。

圖3 暹羅刺盤孢對杉木的致病性Fig.3 Pathogenicity of Colletotrichum siamense to Chinese fir

2.2 杉木赤枯病

菌落特征 分離物TJ－2在PDA培養(yǎng)基上，菌落初期圓形，邊緣平滑；氣生菌絲白色絮狀，生長速度快；反面淺橘色；生長后期，有散生的黑色墨汁狀滲出物，為分生孢子盤(圖4A)。

形態(tài)特征 該病原菌的分生孢子盤為深棕褐色；分生孢子梗光滑無色(圖4B)。分生孢子5個(gè)細(xì)胞，(18.4～30.0)μm ×(5.0～6.2)μm；中間 3個(gè)有色胞同為橄欖色，上2個(gè)有色胞顏色深，第3個(gè)顏色較淺；頂孢無色，具2～3根附屬絲，長度為14.5～21.5 μm；基部無色胞錐形，具1根柄(圖4C)。

圖4 小孢擬盤多毛孢菌落和分生孢子Fig.4 Colony and conidia of Pestalotiopsis microspora

分子生物學(xué)鑒定 以盤色串孢屬Seiridium cardinale(AF409995、AF377298)為外群，構(gòu)建菌株TJ－2的分子系統(tǒng)樹(圖5)。菌株TJ－2與參考菌株P(guān)estalotiopsis microspora(KT372347、 GQ855796、KY366172、MK064589、MK064588、JN314418)位于同一分支，節(jié)點(diǎn)自展值為87，與其他近緣種區(qū)分開來。

圖5 基于ITS基因采用最大似然法構(gòu)建的杉木赤枯病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS gene of the pathogen of Chinese fir copper blight by maximum likelihood method

鑒定結(jié)果 依據(jù)形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，確定杉木赤枯病致病菌為小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora，屬于半知菌類 Deuteromycotina腔孢綱Coelomycetes黑盤孢目Melanconiales擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis。

致病性 接種病原菌TJ－2的孢子懸浮液5 d后，健康杉木針葉接種點(diǎn)周圍出現(xiàn)褐色壞死斑點(diǎn)(圖6A)，對照組無明顯癥狀(圖6B)。對發(fā)病組織進(jìn)行病原物的再次分離，獲到的病原菌與接種的病原菌株TJ－2相同，完成了柯赫氏法則的驗(yàn)證，證明菌株TJ－2是杉木赤枯病的致病菌。

杉木赤枯病在廣南縣杉木林中與其他病害間雜發(fā)生。病菌在枝梢幼嫩的針葉上侵染，初期為褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大形成圓形或不規(guī)則暗褐色病斑，病健交界處通常有赤棕色略隆起的交界線。發(fā)病后期針葉由深紅褐色變灰白色，病斑上有微凸起的黑褐色子實(shí)體產(chǎn)生，最后導(dǎo)致針葉枯死(圖6C)。

圖6 小孢擬盤多毛孢對杉木的致病性Fig.6 Pathogenicity of Pestalotiopsis microspora to Chinese fir

2.3 杉木落針病

形態(tài)特征 子囊盤黑色，成熟時(shí)中央有條縱裂縫(圖7A，B)；子囊棍棒狀，略有短柄，內(nèi)含8個(gè)子囊孢子(圖 7C，D)；子囊孢子單孢，無色，線形，(45.0～80.0)μm ×(2.0～2.5)μm，在子囊內(nèi)束狀排列(圖7E)；側(cè)絲線性，頂端彎曲。

鑒定結(jié)果 通過病原菌形態(tài)特征的比對，與李本國 等[11]、邊銀丙 等[12]、魏景超[13]所描述的一致。因暫未有人從杉木上成功分離到杉木落針病的病原菌，本研究中也未成功分離到該病原菌，無法進(jìn)行分子鑒定，根據(jù)前人的形態(tài)研究將廣南縣杉木落針病的病原暫定為子囊菌門Ascomycotina錘舌菌綱Leotiomycetes斑痣盤菌目Rhytismatales的杉葉散斑殼Lophodermium uncinatum Dark.。

杉木落針病在廣南縣的杉木上普遍發(fā)生。受害針葉初期褪綠變黃，隨著病斑的擴(kuò)展，針葉上形成黃紅色斑塊，最后整葉枯死。在枯死針葉上產(chǎn)生長橢圓形的黑色子實(shí)體，為病原菌的子囊盤(圖7F)。

圖7 杉葉散斑殼及其在杉木上的癥狀Fig.7 Lophodermium uncinatum and its symptoms on the Chinese fir

2.4 暹羅刺盤孢和小孢擬盤多毛孢的復(fù)合侵染將純化后的2種病原菌 C.siamense(KS－10)和P.microspora(TJ－2)分別先后針刺接種5～7 d后，與一種病原菌單獨(dú)接種相比，復(fù)合侵染的病斑明顯增大，顏色明顯加深(圖8)，說明病原菌的復(fù)合侵染比單獨(dú)侵染病害發(fā)生更嚴(yán)重。先接種KS－10再接種TJ－2的發(fā)病癥狀比先接種TJ－2后再接種KS－10的病斑明顯增大(圖8)，說明KS－10菌株的侵染性比TJ－2的侵染性強(qiáng)。接種后的癥狀表現(xiàn)為初期變?yōu)榛揖G色，進(jìn)而為黃褐色斑，最終變?yōu)槌嗪稚煽?，病葉保濕后產(chǎn)生黑色霉點(diǎn)，與自然發(fā)病癥狀相同。發(fā)病組織經(jīng)再分離后均獲得原接種菌，其菌落形態(tài)、分生孢子及大小均與原接種菌KS－10和TJ－2真菌一致，而無菌水接種的葉片均未發(fā)病，符合柯赫氏法則。

圖8 暹羅刺盤孢和小孢擬盤多毛孢復(fù)合侵染癥狀Fig.8 Symptoms of complex infection after inoculation with C.siamense(KS－10)and P.microspora(TJ－2)

在病原菌分離過程中發(fā)現(xiàn)，從同一病枝上同時(shí)分離到C.siamense和P.microspora的概率比單獨(dú)分離到其中一種病原菌的概率大2倍。致病性測定發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)菌種復(fù)合接種侵染比單獨(dú)接種發(fā)病快、發(fā)病重，且先接種C.siamense比先接種P.microspora的杉木針葉病斑擴(kuò)展速度快。結(jié)果表明，C.siamense和P.microspora復(fù)合侵染可以加重杉木病情，且C.siamense的致病力更強(qiáng)。

2.5 三種侵染性病害發(fā)病程度 病害發(fā)病程度調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，廣南縣杉木3種侵染性病害的發(fā)病率為91.33%，病情指數(shù)為52.33。該縣杉木侵染性病害發(fā)生范圍廣且病情嚴(yán)重。

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)外已有一些關(guān)于杉木病害的研究報(bào)道，其中杉木黃化病、杉木炭疽病(Glomerella cingulata)、杉木縮頂病(Pestalotiopsis guepinii)、杉木落針病(Lophodermium uncinatum)、杉木細(xì)菌性葉枯病(Pseudomonas cunninghamiae)、杉苗猝倒病(Fusarium spp.、Pythium spp.、Rhizoctonia solani)等多種杉木病害猖獗為害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14－18]。但關(guān)于幾種病原菌復(fù)合侵染的調(diào)查未見報(bào)道。

本研究中，通過室外調(diào)查、室內(nèi)試驗(yàn)和致病性測定發(fā)現(xiàn)廣南縣杉木林中杉木炭疽病、杉木赤枯病和杉木落針病發(fā)生普遍，引起3種杉木侵染性病害的病原菌依次為暹羅刺盤孢Colletotrichum siamense、小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora和杉葉散斑殼Lophodermium uncinatum。

暹羅刺盤孢C.siamense在熱帶、亞熱帶廣泛分布，寄主繁多，侵染植株后可引起炭疽病[19]。自Prihastuti等[20]首次在咖啡豆上發(fā)現(xiàn)暹羅刺盤孢后，國內(nèi)外報(bào)道不少植物都受到該病原菌的危害[21－22]，但沒有關(guān)于該病原菌危害杉木的相關(guān)報(bào)道。目前，已有多次報(bào)道膠孢炭疽菌C.gloeosporioides可引起杉木炭疽病[14，18，23]，經(jīng)查閱國內(nèi)外的文獻(xiàn)資料，未找到C.siamense引起杉木炭疽病的報(bào)道。筆者通過形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，最終確定引起廣南縣杉木炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢C.siamense。這是世界范圍內(nèi)C.siamense引起杉木炭疽病的首次報(bào)道。

復(fù)合侵染試驗(yàn)結(jié)果顯示，C.siamense和P.microspora復(fù)合侵染時(shí)病斑擴(kuò)展速度大于兩者單獨(dú)接種，并且先接種 C.siamense比后接種C.siamense病斑擴(kuò)展速度更快。廖旺嬌 等[24]研究發(fā)現(xiàn)A和B混合接種病斑擴(kuò)展速度不大于兩者單獨(dú)接種，這與本文研究結(jié)果相反，可能與侵入先后有關(guān)。韓曉勇等[25]研究發(fā)現(xiàn)C.siamense對紫山藥有很強(qiáng)的致病力，這與本研究的結(jié)論相一致，說明暹羅炭疽菌是引起杉木病害的主要病原菌。

在本次調(diào)查研究中，廣南縣杉木3種侵染性病害的發(fā)病率為91.33%，病情指數(shù)為52.33。該縣杉木侵染性病害廣泛發(fā)生，且病情嚴(yán)重。病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)杉木炭疽病、杉木赤枯病和杉木落針病常常在同一株杉木上發(fā)生，并且病組織切片時(shí)發(fā)現(xiàn)C.siamense、P.microspora 和C.gloeosporioides經(jīng)?；旌铣霈F(xiàn)在杉木的枯死針葉上。3種侵染性病害常常復(fù)合侵染，使得杉木病害嚴(yán)重發(fā)生，導(dǎo)致杉木生長停滯，針葉枝條大部分枯死，甚至整株枯死，很大程度上影響了杉木的正常生長和成材。

廣南縣杉木林地情況復(fù)雜，病害多樣且嚴(yán)重，應(yīng)多種防治措施并舉。在杉木種植管理過程中，應(yīng)適地適樹[26]，加強(qiáng)撫育管理的同時(shí)做好病害預(yù)防[27]；及時(shí)除草除灌木，深翻松土，施加氮磷鉀肥[28]。對已發(fā)生的病害及時(shí)清理病株及殘?bào)w，做好病害防治管理，防止病害的進(jìn)一步擴(kuò)散[29]。在發(fā)病杉木林中，挑選抗病植株進(jìn)行培育，篩選優(yōu)良的抗病良種[30]。