劉華偉，李朝緒，李芬，呂朝軍，吳少英，覃偉權(quán)

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南省院士團(tuán)隊創(chuàng)新中心，海南省熱帶油料作物生物學(xué)重點實驗室，海南文昌 571399；2.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，海南?？?570228；3.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228)

重大危險性外來有害生物椰心葉甲Brontispa longissima原產(chǎn)于印度尼西亞和巴布亞新幾內(nèi)亞，主要危害植物心葉組織，造成心葉大量死亡，嚴(yán)重影響棕櫚植物的景觀度和植株的健康生長[1]。2002年首次在海南省?？谑幸訕渖习l(fā)現(xiàn)椰心葉甲[2]，隨后短短幾年便傳播至海南全省[3]。近年來，椰心葉甲在海南省各地檳榔園頻繁發(fā)生，擴散蔓延快[4－5]，對椰心葉甲防治研究仍需加強。椰心葉甲嚙小峰Tetrastichus brontispae是椰心葉甲的蛹期寄生蜂[6]，國內(nèi)外學(xué)者已對椰心葉甲嚙小蜂的成蟲習(xí)性、寄主適應(yīng)性、生物生態(tài)學(xué)特性，以及室內(nèi)大量繁殖和野外釋放等方面進(jìn)行了相關(guān)研究[6－10]。飼養(yǎng)并釋放椰心葉甲嚙小蜂可作為防治椰心葉甲的有效手段。

自然界中的個體在種群進(jìn)化的過程中，為了適應(yīng)生存環(huán)境的變化會產(chǎn)生一系列的變異，當(dāng)這種變異朝著各項生理指標(biāo)下降的方向發(fā)展，就稱之為退化[11]。室內(nèi)飼養(yǎng)的昆蟲退化往往表現(xiàn)在繁殖能力下降、種群整齊度下降、壽命縮短和抗病能力下降等方面。昆蟲退化現(xiàn)象是普遍存在的，目前關(guān)于黑腹果蠅Drosophila melanogaster[12]、煙蚜繭蜂Aphidius gifuensis[13]和管氏腫腿蜂Scleroderma guani[14]種群的退化和復(fù)壯已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)研究，都表明長時間的近親繁殖會導(dǎo)致昆蟲種群的退化，通過回交和外源種群雜交的方法可以有效復(fù)壯。為探究椰心葉甲嚙小蜂種群退化的分子機制，筆者基于椰心葉甲嚙小蜂2個種群的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對差異基因進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 供試蜂種 選用中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所天敵工廠種群(每年復(fù)壯1次)和中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所天敵工廠種群(自2004年引進(jìn)后隔離繁殖，未經(jīng)復(fù)壯)，各設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)20頭，均為1～2日齡的椰心葉甲嚙小蜂(不分雌雄)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 用于對比分析的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中，Genbank登錄號:PRJNA678031。原始數(shù)據(jù)質(zhì)量分析詳見劉華偉等[15]。測序的質(zhì)量較好，可用于后續(xù)差異基因的分析。

1.3 差異基因表達(dá)分析及功能富集分析 皮爾遜相關(guān)系數(shù)(pearson′s correlation coefficient，r2)作為樣品間相關(guān)性的評估指標(biāo)[16]，r2越接近1，說明兩個樣品之間的相關(guān)性越強。通過聚類分析判斷差異表達(dá)基因在不同實驗條件下的表達(dá)模式，在樣品間表達(dá)量相關(guān)性高的基因被歸為一類，使用R語言Pheatmap軟件包對所有比較組的差異基因的并集和樣品進(jìn)行雙向聚類分析，根據(jù)同一基因在不同樣品中的表達(dá)水平和同一樣品中不同基因的表達(dá)模式進(jìn)行聚類，采用Euclidean方法計算距離，采用層次聚類最長距離法(Complete Linkage)進(jìn)行聚類。通過DESeq(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html)軟件對復(fù)壯種群(WC)和保種種群(DZ)進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選差異表達(dá)基因條件為:表達(dá)差異倍數(shù)log2FoldChange＞1，顯著性 P-value＜0.05。 使用topGO進(jìn)行 GO富集分析，顯著富集的標(biāo)準(zhǔn)為P-value＜0.05，確定差異基因行使的主要生物學(xué)功能。將差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，顯著富集的標(biāo)準(zhǔn)為P-value＜0.05，獲得差異基因顯著性富集的通路注釋信息。

1.4 RT-qPCR驗證 選擇與椰心葉甲嚙小蜂各種行為相關(guān)的 7個基因(編號為 DN935，DN4191，DN4534，DN26397，DN14402，DN535，DN1980)進(jìn)行熒光定量PCR，以驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰心葉甲嚙小蜂差異基因表達(dá)量分析 通過對復(fù)壯種群3個重復(fù)(WCA、WCB和WCC)與保種種群3個重復(fù)(DZA、DZB和DZC)間的差異基因表達(dá)量進(jìn)行分析，各樣本間的相關(guān)系數(shù)r2均大于0.95，表示種群內(nèi)各樣本間及復(fù)壯與保種種群之間的相關(guān)性較強(表1)。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，在復(fù)壯種群和保種種群的6個樣本中，高表達(dá)基因和低表達(dá)基因的分布在不同種群之間出現(xiàn)分離，在同一種群的不同生物學(xué)重復(fù)中聚集在一起。表明所用樣本在組內(nèi)的基因表達(dá)模式相似，生物學(xué)重復(fù)性較好，且樣本分組較合理(圖1)。

表1 樣品基因表達(dá)量相關(guān)性Tab.1 Correlation of sequenced samples based on gene expression level

圖1 差異表達(dá)基因表達(dá)模式聚類圖Fig.1 Expression pattern clustering of DEGs

相較于復(fù)壯種群，保種種群(DZ/WC)共有553個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因206個、下調(diào)基因347個。兩組樣本間基因差異表達(dá)的分布情況見圖2。其中，有3個基因的注釋結(jié)果為蜂王漿主蛋白(major royal jelly proteins，MRJPs)，3 個基因的注釋結(jié)果為細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)，它們在保種種群中下調(diào)表達(dá)；此外，還發(fā)現(xiàn)幾種嗅覺相關(guān)蛋白。

圖2 基因差異表達(dá)火山圖分析Fig.2 Volcano plot of DEGs

2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路分析 差異表達(dá)基因共有14個基因顯著富集到分子功能(molecular function，MF)中，并且全部下調(diào)，富集到單氧酶活動(monooxygenase activity)的差異基因數(shù)量最多，占供試基因總數(shù)的28.57%。有25個基因顯著富集到細(xì)胞組分(cellular component，CC)中，其中10個基因上調(diào)，15個基因下調(diào)，富集到細(xì)胞膜(cell membrane)中的差異基因數(shù)量最多，占供試基因總數(shù)的68%。有25個基因顯著富集到生物過程(biological process，BP)中，其中13個基因上調(diào)，12個基因下調(diào)，此分類中各項顯著富集到的差異基因都較少，均為1～2個。在顯著富集的差異基因中，包括幾種氣味受體和細(xì)胞色素 P450(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因GO分類Fig.3 GO classification of DEGs

差異表達(dá)基因共有4條顯著富集的代謝通路，分別為Hh信號通路(Hedgehog signaling pathway)、Hh信號通路－fly(Hedgehog signaling pathwayfly)、胰腺分泌(pancreatic secretion)和神經(jīng)活性配體受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)。因4條通路涉及的基因有重合，所以共計10個差異基因(表2)。

表2 差異表達(dá)基因的顯著富集代謝通路Tab.2 KEGG analysis of DEGs

2.3 RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 在椰心葉甲嚙小蜂保種和復(fù)壯2個種群中，7個基因的表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果是一致的，可以認(rèn)為轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)是可靠準(zhǔn)確的(圖4)。

圖4 各基因轉(zhuǎn)錄組及RT-qPCR統(tǒng)計圖Fig.4 Transcriptome and RT-qPCR of each gene

3 結(jié)論與討論

有研究證明胰蛋白酶(TRINITY＿DN334＿c0＿g1，TRINITY＿DN7050＿c0＿g1)與自身免疫防御有關(guān)[17]，還發(fā)現(xiàn)離子型谷氨酸受體(TRINITY＿DN29200＿c0＿g1)屬于嗅覺相關(guān)蛋白中的離子型受體(IRs)，參與化學(xué)感受基因感覺[18]。在差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析中發(fā)現(xiàn)有2條通路中的基因全部下調(diào)，表示保種種群的椰心葉甲嚙小蜂的自身免疫防御和嗅覺系統(tǒng)可能出現(xiàn)退化。

蜂王漿主蛋白是蜂王漿中的水溶性蛋白，與蜂王漿的生物學(xué)功能和醫(yī)療保健作用可能有密切的關(guān)系，比如蜂王漿主蛋白參與雌蜂的級型分化，為幼蟲發(fā)育提供可利用的氮元素并可能在蜜蜂行為調(diào)控中起作用。另外還發(fā)現(xiàn)蜂王漿主蛋白在其他動物中具有重要的醫(yī)療保健作用，主要表現(xiàn)為高效的抗菌活性、較強的免疫活性和促進(jìn)特殊細(xì)胞增殖等[19]。在椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共檢測出25個蜂王漿主蛋白基因，其中3個基因差異表達(dá)且全部下調(diào)，可以說明保種種群椰心葉甲嚙小蜂的抗菌活性、免疫活性等出現(xiàn)退化。

細(xì)胞色素 P450(cytochrome P450，CYP450)是一個超家族酶系，幾乎存在于昆蟲的所有組織中，參與外源化合物的代謝、蛻皮激素和保幼激素的合成與降解等過程，還可以調(diào)節(jié)昆蟲的生長和發(fā)育[20]。在椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)124個P450基因，其中有3個基因差異表達(dá)，全部下調(diào)。在對飛蝗CYP450的研究中發(fā)現(xiàn)，CYP303A1可能與蛻皮激素代謝調(diào)控和影響新表皮增厚有關(guān)[21]，進(jìn)而搜索椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)一個幼蟲表皮蛋白也同樣下調(diào)，表明保種種群的椰心葉甲嚙小蜂的幼蟲發(fā)育過程可能受阻。但在果蠅的研究中表示，CYP303A1與果蠅剛毛結(jié)構(gòu)和機械感覺有關(guān)[22]，在茶小綠葉蟬 Empoasca flavescens[23]中還發(fā)現(xiàn)CYP303A1參與藥物代謝解毒過程，出現(xiàn)這種情況的原因可能是物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同一個基因在不同物種間可能存在差異。

嗅覺系統(tǒng)是幫助昆蟲識別各種化學(xué)氣味分子，引導(dǎo)昆蟲進(jìn)行覓食、交配、選擇產(chǎn)卵地點和躲避天敵等生命活動的重要系統(tǒng)[24－25]。研究表明，有多種嗅覺相關(guān)蛋白參與了嗅覺識別過程，主要有氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、氣味降解酶(odor degrading enzymes，ODEs)、嗅覺受體(olfactory receptors，OLRs)、氣味受體(odorant receptors，ORs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMPs)及離子型受體(ionotropic receptors，IRs)等[26]。在椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共發(fā)現(xiàn)153個 ORs基因，394個OBPs基因，18個SNMPs基因和16個IRs基因，并未發(fā)現(xiàn)ODEs、OLRs、CSPs相關(guān)基因。在這些基因中，共有7個基因在兩個種群中差異表達(dá)，包括4個ORs基因上調(diào)，2個OBPs基因和1個IRs基因下調(diào)。一般認(rèn)為OBPs和ORs都是在嗅覺識別進(jìn)程中起作用，氣味結(jié)合蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)運氣味分子，氣味受體完成信號的激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)，但在本研究中ORs(上調(diào))和OBPs(下調(diào))的表達(dá)模式相反。在對果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，OR82a基因會抑制果蠅的求偶行為[27]，但其他ORs的功能仍不明確，需要繼續(xù)研究。

通過對椰心葉甲嚙小蜂2個種群的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析，發(fā)現(xiàn)保種種群在一些方面已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的退化，這也表明在室內(nèi)大量繁殖過程中，合理的繁殖技術(shù)和適時的復(fù)壯是非常有必要的，后續(xù)應(yīng)針對退化規(guī)律、復(fù)壯時間等展開研究，以期為更新現(xiàn)有的繁蜂技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐。